JoVE Science Education

Advanced Biology

Introducción a la muerte celular

JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Cell Biology

An Introduction to Cell Death

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

52,643 Views

•

10:06 min

•

April 30, 2023

Overview

Necrosis, apoptosis y muerte celular autofagia son todas las maneras en que las células pueden morir, y estos mecanismos pueden ser inducidos por diferentes estímulos, tales como lesión de la célula, niveles bajos de nutrientes o proteínas de señalización. Mientras que la necrosis se considera una forma “accidental” o inesperada de la muerte celular, existe evidencia que apoptosis y autofagia son tanto programados como “planificadas” por las células.

En este video introductorio, JoVE destaca descubrimientos claves relativas a la muerte celular, incluyendo trabajo reciente realizado en gusanos que ayudó a identificar los genes involucrados en la apoptosis. Luego exploramos cuestiones planteadas por los científicos que estudian la muerte de las células, algunas de las cuales miran muerte diferentes vías y sus interacciones. Finalmente, se discuten varios métodos para evaluar la muerte celular, y observamos cómo los investigadores están aplicando estas técnicas en sus experimentos hoy.

Procedure

Paradójicamente, la muerte celular ayuda a moldear la vida de un organismo. Al igual que cualquier organismo, las células pueden morir como resultado de envejecimiento, debido a una lesión accidental, o después de una infiltración de patógenos una célula pueden sacrificarse para evitar la propagación de la infección. En estas circunstancias, las células pueden seguir vías diferentes de la muerte como apoptosis, autofagia o necrosis. Todos estos tipos muestran características morfológicas específicas. Apoptosis o muerte celular programada conduce a “blebbing” de membrana y fragmentación nuclear. Autofagia, que también está regulada, conduce a la formación de grandes vacuolas que encierra componentes celulares. Por último, la necrosis, que es “no planificado” o accidental, termina por lisis celular.

Este video será discutir descubrimientos importantes que llevaron a la identificación de estos caminos, explorar preguntas que los investigadores todavía se preguntan sobre muerte celular, discutir herramientas usan para responderlas y finalmente revisar unos experimentos de ejemplo.

En primer lugar, vamos a repasar algunos investigadores claves que ayudó a descifrar las vías de muerte celular diferente.

Términos modernos usados para describir estas rutas se remonta a Hipócrates, un médico en la antigua Grecia. Él utilizó el término apoptosis, lo que significa “caída,” para describir el hueso “desmenuzar” observado a raíz de una fractura. Llegando a la era moderna, la primera mención notable de “necrosis” ocurrió en 1859, cuando Rudolf Virchow, en su compilación llamada Patología celular, utiliza este término para describir la “descomposición del tejido avanzado.”

Con los avances en microscopía e histología en la próxima década, en 1877 Carl Weigert y Julius Cohnheim pudieron estudiar necrosis a nivel celular. Proporcionan información sobre las características morfológicas asociadas con este tipo de muerte, como la pérdida de núcleos.

Casi 70 años más tarde, Christian de Duve descubrió “autofagia”, un proceso en el que componentes celulares son engullidos y desglosados por membrana-limitan organelles llamados autophagosomes, que con otro tipo de orgánulo: lisosomas, para destruir aún más su contenido. Ahora sabemos que la autofagia juega realmente un papel dual en la célula, facilitando la supervivencia o inducir la muerte.

En 1972, John Kerr, A. R. Currie y Andrew Wyllie observan otro tipo de muerte celular con morfología peculiar. Desde este proceso piezas involucradas “caída” de las células muertas, le dio el antiguo nombre griego apoptosis. Más tarde, apoptosis fue reconocido como una forma de “muerte celular programada” en 1977, cuando H. R. Horvitz y John Sulston estaban estudiando desarrollo de C. elegans . Notaron que las células específicas experimentaría apoptosis al mismo tiempo en diferentes gusanos.

Puesto que esto estaba ocurriendo desde el principio durante el desarrollo, insinuó que genes pueden guiar a apoptosis. Esta hipótesis fue confirmada por el grupo de Horvitz en el decenio de 1980, cuando observaron que las células con mutaciones en ciertos ced o “Muerte de laC. elegans” genes no mueren durante el desarrollo de estos gusanos. Más adelante, Horvitz demostró que el gene ced-3 codifica una enzima de degradación de la proteína llamada una caspasa. Ahora, sabemos que hay varias caspasas y desempeñan un papel importante en la muerte celular.

Estos avances en el campo de la muerte de la célula abrieron nuevos caminos para los investigadores a explorar. Echemos un vistazo a algunos de ellos.

Siempre ha habido interés en averiguar qué factores desencadenan la muerte celular. Para identificarlas, los investigadores son actualmente exponiendo las células a la radiación, productos químicos, moléculas señalizadoras y luego buscar cambios en el grado o tipo de muerte.

Otros científicos están interesados en dilucidar las vías bioquímicas involucradas en cada mecanismo de muerte celular. En la actualidad, sabemos que la apoptosis sigue un camino donde caspasas son las enzimas claves, considerando que la autofagia consiste en proteínas que son necesarias para la formación de autophagosome. Sin embargo, hay componentes de estas vías que son desconocidas, y los investigadores tratan de averiguar la manera de explicarlos. Además, los investigadores también están estudiando si se produce cualquier “interferencia” entre vías de muerte celular. Si hay una interferencia, la misma señal puede factor en apoptosis y autofagia.

Por último, un área popular de la investigación trata de comprender por qué ciertas células, como células cancerosas, convertirse en inmortal. Los científicos constantemente buscando mutaciones en las células cancerosas y determinar si alguno de ellos afectan a genes que codifican los factores involucrado en caminos de muerte.

Estas son todas las preguntas complicadas, pero afortunadamente los investigadores tienen una variedad de herramientas a su disposición para darles respuesta.

El ensayo de azul de tripano es una herramienta de detección utilizados para evaluar el efecto de un compuesto en la muerte celular. El ensayo se basa en una mancha que no puede entrar en las células vivas, que poseen “membranas selectivas”, pero que fácilmente puede entrar células muertas como sus membranas son “roto”. Este ensayo identifica la muerte celular, pero no identificar la vía de muerte celular específica.

Por lo tanto, los científicos han diseñado técnicas como ensayos de actividad de la caspasa. Desde caspasas son activadas durante la apoptosis, los científicos pueden añadir sustratos para estas enzimas que es fluorescente cuando está activadas por caspasas. Esto ayuda en la identificación de células apoptóticas.

Del mismo modo, fragmentación del ADN que ocurre durante la apoptosis se puede identificar fácilmente mediante el ensayo TUNEL, que se basa en los reactivos etiqueta los extremos “mellados” de la DNA dañada. Este método es relativamente fácil de realizar, es un ensayo comúnmente empleado en el campo.

Cuando los científicos quieren determinar el mecanismo de muerte celular que ocurre en su población, puede asociar la anexina V y yoduro de propidio (PI) las manchas con análisis de citometría de flujo. Anexina V se une a residuos de fosfatidilserina en la membrana, mientras que el PI entra a través de las membranas dañadas para asociar con el ADN. Mediante el estudio de los datos obtenidos, los científicos pueden separar las células en vías de muerte diferentes.

Por último, los científicos pueden utilizar imágenes de células vivas para ver el proceso de muerte celular en tiempo real. Se trata de una técnica global que puede utilizarse para identificar necrosis, autofagia, o células apoptóticas basadas en características morfológicas.

Como has visto, hay varios métodos para detectar la muerte celular, algunos de los cuales no son específicos, otros que pueden ayudar a identificar células apoptóticas, y algunos que distinguen entre diferentes vías.

Ahora, vamos a ver cómo los científicos están utilizando estas técnicas para estudiar más acerca de la muerte celular.

Dieta juega un papel importante en la salud y puede afectar a la muerte celular en diferentes tejidos. En este ensayo en vitro , los investigadores exponen las neuronas de ratón a ácido palmítico, un ácido graso saturado presente en productos lácteos y carne y entonces utilizó un ensayo de caspasas para evaluar apoptosis. Descubrieron que las células tratadas por el ácido palmítico demostraron caspasa mayor actividad y muerte celular.

Otros investigadores utilizan estos análisis para determinar cómo las drogas inducen mecanismos de muerte diferentes. Aquí, se inyectaron ratones transgénicos con células de cáncer fluorescencia etiquetada con doxorrubicina, un medicamento contra el cáncer. Las células los científicos entonces reflejadas en animales vivos y buscando cambios en la morfología de la célula de cáncer, determinan que tratamiento de drogas desencadena apoptosis y necrosis.

Por último, algunos científicos están investigando si la muerte celular puede ser revertida. En este experimento, los investigadores exponen las células cancerosas humanas a etanol y confirmaron a través de una variedad de ensayos que este tratamiento hizo que embarcarse en la vía de apoptosis. Al eliminar el etanol con el lavado, las células afectadas pudieron recuperar de apoptosis a través de un proceso llamado “anastasis”. Esto proporcionó la penetración en cómo cánceres pueden volver después del tratamiento de drogas.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a las vías de muerte celular. Este video repasa la rica historia de investigación de la muerte de la célula, desde la antigüedad hasta el siglo XX y entonces se discuten algunas cuestiones actuales. También explicó métodos para ensayo de muerte celular y demostró cómo se utilizan estas técnicas para comprender mejor la conexión entre el medio ambiente, enfermedad y muerte celular. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Paradoxically, cell death helps shape an organism’s life. Just like any whole organism, cells can die as a result of aging, due to accidental injury, or following a pathogen infiltration a cell can sacrifice itself to prevent the spread of infection. Under these circumstances, cells can follow different death pathways like apoptosis, autophagy, or necrosis. All these types display specific morphological characteristics. Apoptosis or programmed cell death leads to membrane “blebbing” and nuclear fragmentation. Autophagy, which is also regulated, leads to formation of large vacuoles enclosing cellular components. Lastly, necrosis, which is “unplanned” or accidental, ends in cell lysis.

This video will discuss important discoveries that led to the identification of these pathways, explore questions that researchers are still asking about cell death, discuss tools they use to answer them, and finally review a few example experiments.

First, let’s review some key researchers who helped to decipher different cell death pathways.

Modern terms used to describe these paths can be traced back to Hippocrates, a physician in ancient Greece. He used the term apoptosis, meaning “falling off,” to describe bone “shredding” observed following a fracture. Coming to the modern era, the first noticeable mention of “necrosis” occurred in 1859, when Rudolf Virchow—in his compilation called Cell Pathology—used this term to describe “advanced tissue breakdown.”

With advances in microscopy and histology over the next decade, in 1877 Carl Weigert and Julius Cohnheim were able to study necrosis at the cellular level. They provided insight into the morphological features associated with this type of death, like the loss of nuclei.

Almost 70 years later, Christian de Duve discovered “autophagy,” a process in which cellular components are engulfed and broken down by membrane-bound organelles called autophagosomes, which fuse with another type of organelle—lysosomes—to further destroy their contents. We now know that autophagy actually plays a dual role in the cell, either facilitating survival or inducing death.

In 1972, John Kerr, A. R. Currie, and Andrew Wyllie observed another type of cell death with peculiar morphology. Since this process involved pieces “falling off” of dead cells, they gave it the ancient Greek name apoptosis. Later, apoptosis was recognized as a form of “programmed cell death” in 1977, when H. R. Horvitz and John Sulston were studying C. elegans development. They noticed that specific cells would undergo apoptosis at the same time in different worms.

Since this was happening early on during development, it hinted that genes may guide apoptosis. This hypothesis was confirmed by Horvitz’s group in the 1980’s, when they observed that cells with mutations in certain ced or “C. elegans death” genes didn’t die during the development of these worms. Later, Horvitz showed that the ced-3 gene encodes a protein-degrading enzyme called a caspase. Now, we know that there are several caspases, and they play major roles in cell death.

These advances in the cell death field opened new roads for researchers to explore. Let’s look at some of them.

There has always been interest in finding out what factors trigger cell death. To identify them, researchers are currently exposing cells to radiation, chemicals, and signaling molecules, and then searching for changes in the degree or type of death.

Other scientists are interested in elucidating the biochemical pathways involved in each cell death mechanism. Currently, we know that apoptosis follows a pathway where caspases are the key enzymes, whereas autophagy involves proteins that are necessary for autophagosome formation. However, there are components in these pathways that are unknown, and researchers are trying to figure out ways to explain them. In addition, researchers are also studying whether any “crosstalk” occurs between cell death pathways. If crosstalk is present, then the same signal can factor in apoptosis, as well as autophagy.

Lastly, a popular area of research deals with understanding why certain cells—like cancer cells—become immortal. Scientists are constantly looking for mutations in cancer cells, and assessing whether any of them affect genes encoding factors involved in death pathways.

These are all complicated questions, but luckily researchers have a variety of tools at their disposal to answer them.

The trypan blue assay is a commonly used screening tool to assess the effect of a compound on cell death. The assay relies on a stain that cannot enter live cells, as they posses “selective membranes,” but can easily enter dead cells as their membranes are “ruptured.” This assay identifies cell death, but fails to pinpoint the specific cell death pathway.

Therefore, scientists have designed techniques like caspase activity assays. Since caspases are activated during apoptosis, scientists can add substrates for these enzymes that fluoresce when they’re activated by caspases. This helps in the identification of apoptotic cells.

Similarly, DNA fragmentation that happens during apoptosis can be easily identified using the TUNEL assay, which relies on reagents that tag the “nicked” ends of damaged DNA. As this method is relatively easy to perform, it is a commonly employed assay in the field.

When scientists want to determine the cell death mechanism occurring in their population, they can pair annexin V and propidium iodide (PI) stains with flow cytometry analysis. Annexin V binds to phosphatidylserine residues in the membrane, whereas PI enters through the damaged membranes to associate with DNA. By studying the resulting data, scientists can separate cells undergoing different death pathways.

Lastly, scientists can use live cell imaging to view the cell death process in real time. This is an all-encompassing technique that can be used to identify autophagic, necrotic, or apoptotic cells based on unique morphological features.

As you’ve seen, there are several methods to detect cell death, some of which are not specific, others that can help identify apoptotic cells, and some that distinguish between different pathways.

Now, let’s see how scientists are using these techniques to study more about cell death.

Diet plays an important role in health, and may affect cell death in different tissues. In this in vitro assay, researchers exposed mouse neurons to palmitic acid, a saturated fatty acid present in both dairy products and meat, and then used a caspase assay to evaluate apoptosis. They discovered that palmitic acid-treated cells demonstrated increased caspase activity and cell death.

Other researchers are using these assays to determine how drugs induce different death mechanisms. Here, transgenic mice with fluorescently labeled cancer cells were injected with doxorubicin, an anti-cancer drug. Scientists then imaged cells in live animals, and by looking for changes in cancer cell morphology, determined that drug treatment triggered both apoptosis and necrosis.

Finally, some scientists are investigating whether cell death can be reversed. In this experiment, researchers exposed human cancer cells to ethanol, and confirmed through a variety of assays that this treatment caused them to embark on the apoptosis pathway. Upon washing off the ethanol, affected cells were able to recover from apoptosis through a process called “anastasis.” This provided insight into how cancers can return following drug treatment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell death pathways. This video reviewed the rich history of cell death research—from ancient times to the 20th century—and then discussed a few current questions. We also explained popular methods to assay cell death, and demonstrated how these techniques are being used to better understand the connection between environment, disease, and cell death. As always, thanks for watching!

Tags

Valor vacío tema