Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

El objetivo general de este protocolo es rastrear el crecimiento tumoral y la metástasis en roedores vivos a través de imágenes. Un reportero de fusión de fluorescencia con radionúclidos permite la detección in vivo no invasiva mediante tomografía por emisión de positrones con el fluoróforo ayudando a la confirmación ex vivo de los resultados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave cuando es necesario rastrear células en animales vivos durante un período de tiempo prolongado.

Puede contribuir a la comprensión de la metástasis a distancia y el impacto de los tratamientos en la progresión tumoral. La técnica descrita es el seguimiento de células cancerosas mediante imagen in vivo altamente sensible y no invasiva con un trazador PET producido por síntesis automatizada. Ofrece una reducción significativa del uso de animales en comparación con la metodología convencional.

Las personas nuevas en este método pueden sentirse abrumadas por su complejidad. En particular, la síntesis automatizada del radiotrazador PET simplifica significativamente este proceso. Creemos que la demostración visual de este método demuestra estos puntos de vista de los pasos críticos asociados a la obtención de imágenes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a las pruebas preclínicas de nuevas terapias que también se pueden rastrear junto con las células cancerosas. Este método puede proporcionar información sobre la biología del cáncer y el desarrollo de tratamientos. Siempre que sea de interés la localización in vivo, la reubicación, la expansión y el seguimiento a largo plazo de una determinada población.

Para empezar, utilice plásmidos de genes reporteros, genere partículas de Lentivirus, transduca células y caractérelas. A continuación, analice la función del gen reportero mediante la captación de radiotrazadores en las líneas celulares que expresan NISFP. Siembre las células purificadas y el medio de crecimiento en placas de seis pocillos, asegurándose de que todas las muestras se preparen por triplicado.

A la mañana siguiente, lavar las células con medio de crecimiento libre de suero e incubar las placas con 50 kilos de becquerelios de tetrafluoroborato F18 a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, recoja el sobrenadante y transfiera 100 microlitros a un tubo de recogida preetiquetado. Deseche el sobrenadante restante, luego lave las células con un mililitro de PVS helado que contiene calcio y magnesio a niveles fisiológicos.

Recoja la solución de lavado y transfiera 100 microlitros de la solución de lavado a un tubo de recolección preetiquetado. A continuación, repita el proceso de lavado una vez más. Agregue 500 microlitros de PVS que contengan tripsina y EDTA para levantar las células.

Incubar las muestras a 37 grados centígrados hasta que las células se desprendan, utilizando un microscopio para comprobar si hay desprendimiento. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de recolección etiquetado. A continuación, centrifugar las muestras celulares a 250 g durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.

Utilice un contador gamma automatizado para contar las muestras de cada uno de los cuatro tipos de muestras y obtener el porcentaje de absorción utilizando la ecuación uno. Para comenzar la síntesis de tetrafluoroborato F18, configure la plataforma de síntesis de radio automatizada en una cubierta química adecuada y asegúrese de que se cargue el archivo XML correcto en la computadora de control. Mientras el sintetizador funciona, se producirá tetrafuoroborato F18 y luego se purificará en un cartucho de intercambio aniónico.

El cartucho de intercambio aniónico se enjuagará con agua y luego se secará con gas nitrógeno. El producto final se alude desde el cartucho de intercambio aniónico con un mililitro de cloruro de sodio al 0,9% y se transfiere a un vial de recolección de vidrio a través de la línea de salida. Para comenzar la toma de imágenes, anestesiar y preparar a los ratones de acuerdo con el protocolo escrito.

A continuación, utilice solución salina estéril al 0,9% para diluir la solución de tetrafluoroborato F18 a 5 megabecquerelios por 50 microlitros. Utilice una jeringa con una aguja hipodérmica para extraer 100 microlitros de la solución de tetrafluoroborato F18. Mida la radiactividad en la jeringa y registre el valor y el tiempo de medición.

Administre 50 microlitros de la solución de tetrafluoroborato F18 en el vano de cola precalentado por vía intravenosa. A continuación, mida la radiactividad restante en la jeringa y registre el valor y el tiempo de medición. La inyección de la radiosonda en la vena de cola es fundamental.

Lo realizamos bajo anestesia animal para minimizar el riesgo de inyección incorrecta y derrame de radiotrazador. El animal permanece bajo anestesia hasta el inicio de la adquisición de la imagen PET. Exactamente 45 minutos después de la inyección de la radiosonda.

A continuación, configure un temporizador para que la cuenta regresiva sea de 45 minutos y asegúrese de que el mouse esté colocado en la mesa en posición esternal. Instale los instrumentos de monitoreo quirúrgico adecuados y asegúrese de que los instrumentos funcionen correctamente antes de continuar. A continuación, configure los perímetros para la adquisición de imágenes por TC y PET.

Cuando el temporizador de cuenta regresiva marque 15 minutos, comience la adquisición de imágenes CT y cuando el temporizador marque cero minutos, comience la adquisición de imágenes PET. Primero mida la radiactividad de todo el ratón sacrificado y registre el valor y el tiempo de la medición. A continuación, disecciona los ratones y recoge los tejidos necesarios.

Mida la radiactividad del cadáver restante con y sin la cola. Registre estos valores y anote los tiempos de medición. A continuación, pese todos los tejidos extraídos individualmente y tome fotografías de los órganos cancerosos bajo la luz del día y bajo la luz de fluorescencia.

A continuación, incruste los tejidos en la OCT para la histología posterior. Mida la radiactividad de todos los tejidos recolectados, registre el valor y anote el tiempo de medición. Por último, presente los datos como valores de absorción estándar o SUV como se describe en la ecuación dos.

En este experimento, se utilizaron imágenes génicas de registro de florescencia de radionúclidos para rastrear la progresión tumoral en un modelo de tumor de roedores. La microscopía de fluorescencia confocal demostró una localización precisa de los NISFP en la membrana plasmática. La función y especificidad de NISFP se cuantificó mediante la captación de radiotrazadores proporcionados por NIS.

No se observaron diferencias significativas entre las líneas celulares que expresan 4T1NISGFP y 4T1NISRFP con niveles de expresión de NIS similares. Es importante destacar que el bloque de preclorato demostró en todas las líneas celulares que la absorción de radiotrazador obtenida se debe a la expresión específica de NISFP. Las imágenes PET de cuerpo entero de animales portadores de tumores revelaron información sobre la progresión del tumor y la diseminación metastásica.

El ejemplo que se muestra aquí muestra metástasis extensas y largas con varios nódulos distintos en el pulmón. Variaron los valores porcentuales de dosis inyectadas y los volúmenes ocupados de metástasis individuales en los pulmones. Sin embargo, los valores de la dosis porcentual inyectada normalizada por volumen estuvieron dentro de un rango similar.

La proteína fluorescente en el gen reportero de modo dual permitió la identificación de tejido canceroso bajo la luz de la florescencia durante la disección animal. La posterior distribución ex vivo de radiotrazadores biológicos reveló órganos con una alta absorción de radiotrazadores y, por lo tanto, tejidos que expresan NIS. Si bien la tiroides y las glándulas salivales, así como el estómago, expresan NIS de forma autóctona, todas las demás señales positivas son indicativas de tejidos cancerosos como el tumor y las metástasis.

El indicador de fluorescencia de radionúclidos también permite la identificación de células cancerosas en secciones de tejido posteriores. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer visualizaran el proceso de metástasis espontánea y probaran cómo los medicamentos lo afectan. Al intentar este procedimiento, es importante planificar cuidadosamente todos los pasos con anticipación.

Se deben establecer líneas celulares, configurar modelos de tumores animales y todos los reactivos y equipos para la obtención de imágenes deben estar disponibles el día requerido. Recomendamos pequeños experimentos piloto para empezar. Una vez dominado, la producción de radiotrazadores y la obtención de imágenes in vivo de animales se pueden realizar con seis animales en una jornada laboral de ocho horas si se realizan correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo abordar un gen reportero que permite el seguimiento celular in vivo utilizando el radionúclido reportero NIS combinado con una proteína fluorescente. También debe ser capaz de caracterizar líneas celulares que expresan el reportero NISFP para producir el radiotrazador PET necesario para la obtención de imágenes in vivo y para realizar experimentos in vivo y ex vivo mediante distribución. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la fluorocitometría para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, cómo el perfil de células inmunitarias de un tumor y su metástasis se relacionan entre sí o cambian con el tiempo. No olvide asegurarse de que las líneas celulares que produzca estén libres de microplásmidos, ya que se ha informado que estos últimos afectan los resultados. Es importante destacar que no olvide que trabajar con radioisótopos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se debe priorizar la protección personal y de los demás al realizar este procedimiento.