Video-EEG-ECG simultánea de monitoreo para identificar la disfunción neurocardiaco en modelos de ratón de la epilepsia

Aquí, presentamos un protocolo para registrar el cerebro y corazón bio señales en ratones usando video simultáneo, electroencefalografía (EEG) y electrocardiografía (ECG). También se describen métodos para analizar las grabaciones de EEG ECG resultantes para convulsiones, energía espectral del EEG, la función cardiaca y variabilidad del ritmo cardíaco.

El objetivo general de este procedimiento es medir las bioseñales cerebrales y cardíacas en ratones utilizando grabaciones simultáneas de video, electroencefalografía y electrocardiografía. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epilepsia, como si una mutación genética en ratones causa convulsiones espontáneas y si las convulsiones evocan arritmias cardíacas. La principal ventaja de esta técnica es que la configuración de grabación conectada permite más canales de grabación de biopotencial que los sistemas inalámbricos y utiliza electrodos que son relativamente baratos y desechables.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la disfunción cardíaca en la epilepsia, también se puede aplicar al estudio de la neurocardiología para identificar asociaciones entre las arritmias y la actividad cerebral anormal. Para comenzar este procedimiento, coloque el conector nano hembra de 10 zócalos en un tornillo de banco de mesa con los 10 cables hacia arriba y el cable negro en la parte delantera. Con pinzas finas, dobla el alambre negro hacia la derecha y el alambre marrón hacia la izquierda.

A continuación, dobla los cables rojo, naranja, azul y morado alternando a la derecha y a la izquierda. Luego, corte los cables amarillos, verdes, blancos y grises en la base de su fijación. Para preparar los cables de ECG, use un marcador permanente para hacer marcas en el alambre morado a 3,2 centímetros y 3,5 centímetros de la base del electrodo y en el alambre azul a 2,2 centímetros y 2,5 centímetros.

Retire el electrodo del tornillo de banco y exponga los filamentos de plata entre las áreas marcadas pelando el aislamiento en el costado del cable con una hoja de bisturí. A continuación, vuelva a colocar el electrodo en el tornillo de banco. Fije un trozo de cinta de montaje de doble cara, que debe cortarse previamente a la longitud y el ancho del electrodo a la parte superior de los cables con una capa delgada de superpegamento.

A continuación, recorte los cables que se van a utilizar para el EEG en un ángulo ligeramente en forma de V hasta una longitud de aproximadamente siete a nueve milímetros, con los cables de color canela y negro cortados al más corto. Tenga en cuenta que no debe cortar los cables que se utilizarán para el ECG. En este procedimiento, afeite dos áreas pequeñas de unos dos centímetros cuadrados a ambos lados del tronco del ratón correspondientes a donde se implantarán los cables de ECG.

A continuación, coloque el ratón en posición prona en la platina del microscopio de disección y confirme la profundidad adecuada de la anestesia mediante la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie. Sosteniendo la cabeza firmemente entre el pulgar y el índice, separe el pelaje por el centro de la cabeza desde entre las orejas hasta justo detrás de los ojos con un hisopo de algodón empapado en alcohol. Con un bisturí, haga una incisión de un centímetro en la línea media del cuero cabelludo entre el pelaje dividido, desde justo delante de las orejas hasta justo entre los ojos.

Usando el costado del bisturí o un aplicador de punta de algodón, raspe suavemente la membrana mucosa en la parte superior del cráneo hasta que el hueso parezca seco. A continuación, arranca el pelaje alrededor del perímetro de la incisión formando un borde fino de piel calva. Retire con cuidado cualquier pelo que pueda haber caído en el campo quirúrgico con un par de pinzas.

Seque la superficie del cráneo con un aplicador de punta de algodón aplicando una presión suave durante varios segundos si es necesario. Después de eso, haga cuatro marcas en el cráneo con un marcador permanente en los sitios donde se perforarán los agujeros de rebaba. Coloque dos marcas, una a cada lado de la sutura sagital, anterior al bregma para los cables de referencia y tierra.

A continuación, coloque otras dos marcas, una a cada lado de la sutura sagital posterior al bregma para los dos hilos de registro del EEG. Con un microtaladro, haga pequeños agujeros de rebaba en cada marca con una broca de 0,8 milímetros de diámetro. Aplique una presión suave mientras perfora para crear pequeños huecos en cada punto marcado.

Perfore el cráneo pulsando la broca a medida que el orificio se acerca a su finalización, asegurándose de no aplicar demasiada presión, lo que podría penetrar y dañar el tejido cerebral subyacente. Después de perforar todos los agujeros, limpie el área con un aplicador de punta de algodón. Para adherir el electrodo a la parte superior del cráneo, retire el respaldo de papel de la cinta de montaje de doble cara en el electrodo.

Aplica una capa delgada de superpegamento a la cinta. Con un par de pinzas, retire el electrodo del tornillo de banco. Oriente el electrodo de tal manera que, cuando se coloque a lo largo de la sutura sagital, los cables de EEG más cortos sean rostrales y los cables de ECG más largos sean caudales.

Adhiera el electrodo al cráneo sobre la sutura sagital entre los orificios. Para implantar los cables para ECG, gire el mouse ligeramente hacia su lado derecho, mientras mantiene la cabeza en posición vertical. Tome el cable largo de ECG en el lado izquierdo y extiéndalo por el costado del mouse hasta el área afeitada en el lado izquierdo.

Visualice dónde se colocará el cable expuesto una vez que se tunelice debajo de la piel. Luego, con un bisturí, haga una incisión de un centímetro en la piel en el lugar donde se colocará el alambre expuesto. Mientras mantiene la incisión abierta, use fórceps para aflojar la piel alrededor de la incisión del tejido conectivo subyacente para formar un bolsillo para el alambre.

Comenzando en el sitio de la incisión en el costado del animal, túnel subcutáneo con un trozo de tubo de polietileno de seis centímetros de largo con un borde delantero biselado hasta que el borde biselado salga de la incisión realizada en la cabeza. Pase el alambre de ECG a través del tubo. Mientras retira el tubo, sujete el alambre del electrodo a medida que sale de la incisión lateral y tire del cable para tensarlo.

A continuación, fije el alambre de ECG en su lugar suturándolo al tejido debajo de la piel. Aplique una sutura sobre los filamentos expuestos y otra sutura antes o después de la parte expuesta. Corte el alambre del electrodo unos dos o tres milímetros más allá de la última sutura y meta el extremo en el bolsillo de piel formado anteriormente.

Después de eso, junte dos lados de la incisión y ciérrelos con una pinza para heridas. Repita los pasos anteriores para colocar el alambre de ECG contralateral. Para implantar los alambres para EEG, comenzando por el orificio más anterior en un lado, doble el alambre que está más cerca de ese orificio para que se coloque directamente sobre el orificio, pero aún no se haya insertado.

Agarre el extremo inferior del alambre y páselo lo más horizontalmente posible en el orificio hasta que dos o tres milímetros del alambre estén debajo del cráneo. Con el extremo del alambre asegurado en el agujero, dobla suavemente la parte restante del alambre para que quede plana contra el cráneo. Continúe de la misma manera con el alambre posterior del mismo lado.

Repita los procedimientos para los alambres anterior y posterior del otro lado. En este procedimiento, mezcle dos cucharadas de polvo de policarboxilato con cinco gotas de líquido de policarboxilato. Revuelva la mezcla con un palillo para hacer una pasta con la viscosidad deseada.

A continuación, recoge una gran gota de cemento con el palillo y aplícala alrededor de la base del electrodo, empezando por la caudal. Continúe alrededor del electrodo permitiendo que el cemento gotee sobre los alambres, formando una tapa alrededor del implante. Con las pinzas de Dumont, tire del pelo en los bordes de la incisión hacia arriba sobre la tapa de cemento y presióne, teniendo cuidado de no tocar los alambres implantados debajo.

Posteriormente, presiona el pelaje hacia arriba en el cemento para ayudar con el cierre. Después de un período de recuperación, sujete el mouse sujetándolo suave pero firmemente con una mano mientras usa la otra mano para insertar el conector metálico de 10 pines con guía en las cuencas del EEG, implante de electrodo de ECG en la cabeza del mouse. A continuación, transfiera el ratón a una cámara de grabación con paredes transparentes para facilitar la monitorización de vídeo.

Grabe vídeo y EEG, ECG simultáneos y guarde los datos digitalizados para análisis fuera de línea con software de procesamiento de señales. Aquí se muestra un rastro de EEG que representa una convulsión espontánea en un ratón knockout KCNA1. Este es un gráfico de la duración de cada convulsión observada durante la sesión de grabación de 24 horas en el ratón.

Y este espectrograma muestra la frecuencia y la densidad de potencia antes, durante y después de una convulsión. La comparación de la potencia relativa en cada banda de frecuencia del EEG durante los períodos pre y postictal revela un aumento en la potencia delta relativa y disminuciones en la potencia theta, alfa, beta y gamma. Y este es un gráfico representativo de una serie de intervalos R-R obtenida a partir del registro de ECG del ratón knockout KCNA1, que muestra las fluctuaciones en el tiempo entre latidos.

La línea roja muestra los componentes de la tendencia de baja frecuencia que se eliminan de la serie de intervalos R-R después de la eliminación de tendencia. A continuación se muestra un ejemplo de traza de ECG de un ratón knockout KCNA1 que muestra un ritmo sinusal normal que precede a un bloqueo de conducción auriculoventricular, que se manifiesta como una onda P que no es seguida por el complejo QRS. Una vez dominada, esta cirugía se puede realizar en 50 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo implantar electrodos para registrar electroencefalografía y electrocardiografía en ratones, que se pueden aplicar en modelos de epilepsia para identificar la disfunción neurocardíaca.