Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto - e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurofisiología, como el papel causal de la oscilación theta en la navegación especial y los comportamientos asociados. La principal ventaja de esta técnica es que permite un control en tiempo real sobre la frecuencia y regularidad de las oscilaciones theta del hipocampo en ratones que se comportan. La Dra. Franziska Bender, una ex estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Comience con el ratón completamente anestesiado asegurado en el marco estereotáxico. Perfora un orificio por encima del tabique medial. Sumerja la punta de la aguja de inyección en una gota de virus sobre un trozo de película de parafina y extraiga cuidadosamente el virus a unos 500 nanolitros por minuto mientras observa el nivel del líquido.

Para evitar que el aire entre en la aguja de inyección, detenga la extracción antes de que el virus se haya absorbido por completo. Limpie la aguja con un pañuelo de papel. Compruebe que el virus y el aceite estén separados por una burbuja de aire y marque el nivel del virus en el tubo.

Coloque la aguja por encima de la craneotomía e insértela lentamente en el cerebro en el primer punto de inyección. Inyecta 450 nanolitros del virus a una velocidad de 100 a 150 nanolitros por minuto. Después de la inyección, espere 10 minutos.

Después de 10 minutos, mueva con cuidado la aguja hacia arriba 0,1 milímetros y espere otros cinco minutos. Utilice un micro separador para quitar 125 micrómetros de revestimiento de una fibra óptica multimodo mientras la fibra aún está unida al carrete de fibra. Luego, use un cuchillo de diamante para cortar la fibra a una longitud de aproximadamente dos a tres centímetros.

Inserte la fibra óptica en una férula de varilla de cerámica de circonio con un diámetro interno de 126 micras. Aproximadamente de 0,5 a un milímetro de la fibra debe sobresalir del lado convexo de la férula. Con una aguja, aplique una gota de pegamento epoxi en ambos extremos de la férula, pero no en los lados de la férula.

Después del secado, use una película de pulido de fibra de lapeado de diamante con granos de tres micras para pulir el lado convexo de la férula. Para preparar la matriz de alambre de tungsteno, primero pegue varias guías de tubos de sílice de 100 micras al lado adhesivo de un trozo de cinta. A continuación, utilice pinzas para enhebrar alambres de tungsteno de 45 micras aislados con formvar a través de los tubos guía.

A continuación, utilice un bisturí para pelar el aislamiento de ambos extremos de seis cables de unión de cobre fino aislados con esmalte de aproximadamente cinco milímetros de largo. Luego, pele el aislamiento de ambos extremos de un cable de conexión a tierra de aproximadamente dos a tres centímetros de largo. Suelde cada cable pelado a los pines del nanoconector.

Conecte cada cable de unión a un cable de tungsteno con una gota de pintura conductora de plata. Después del secado, aplique una pequeña cantidad de cemento para cubrir los alambres de cobre. Evite aplicar cemento en la parte superior del nanoconector.

Después de dejar que el cemento se seque durante al menos 30 minutos, use unas tijeras romas de acero inoxidable para cortar los alambres de tungsteno en un ángulo de cinco a 20 grados. Comience perforando cuatro orificios de 0,8 mm de diámetro en el cráneo limpio del animal anestesiado. Taladre dos orificios rostral hasta la sutura coronal y dos por encima del cerebelo.

A continuación, coloque tornillos óseos de acero inoxidable para la conexión a tierra y la estabilización del implante. Coloque el tornillo de tierra conectado a un cable de cobre sobre el cerebelo. Cubra el tornillo de tierra completamente con cemento para evitar artefactos musculares durante los registros electrofisiológicos.

Construya un anillo de enmendado que conecte todos los tornillos. Realice una craneotomía por encima del sitio de implantación, luego aplique aproximadamente un microlitro de solución salina estéril en la superficie del tejido cerebral. Use la estereotasa para bajar lentamente el conjunto de cables hacia la craneotomía.

A continuación, aplique aproximadamente cinco microlitros de cera líquida tibia sobre el lugar de implantación para proteger el tejido cerebral. Aplique cemento alrededor del conjunto de alambres y cubra el cráneo con cemento. Aplique una gota de fundente al cable de tierra presoldado o al cable presoldado conectado al tornillo de tierra, y fusione los cables con una máquina de soldar.

Por último, cubra todo el cable de tierra con cemento. Compruebe la salida de luz del cable de conexión. Si la velocidad de transmisión de la fibra implantada fue del 50%, asegúrese de que la salida de luz en la punta del cable de conexión sea de 20 milivatios.

Conecte el preamplificador de la etapa principal al conector implantado y conecte el cable de conexión de fibra óptica a la fibra del hipocampo implantada para la estimulación optogenética. Registre el comportamiento de la línea base durante un período adecuado para los parámetros que se están midiendo. Abra el software para controlar el generador de estímulos.

Haga clic en archivo, abra y seleccione el archivo de protocolo de su elección. Haga clic en descargar y comience a iniciar la estimulación de luz. Observa el control del ritmo theta por los pulsos de luz.

Aquí se observa el potencial de campo local del hipocampo durante las oscilaciones theta espontáneas. Fíjate en las envolventes gamma, un indicador del ritmo theta fisiológico. Aquí se observa el potencial de campo local del hipocampo a siete hercios durante el arrastre optogenético.

Las franjas azules indican las ventanas de tiempo de aplicación de la luz. Obsérvese el restablecimiento de fase por el pulso de luz indicado aquí por una flecha. El potencial de campo local del hipocampo a 10 hercios refleja el arrastre optogenético.

Obsérvese que las envolventes gamma bloqueadas en fase y la inversión de fase entre los stratham orians y el stratum radiatum también se mantienen durante el arrastre. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas de tiempo de experimento, más seis semanas para la expresión viral. Al intentar este procedimiento, es esencial recordar garantizar una transducción viral eficiente.

Conecte correctamente el implante de fibra óptica al cable de conexión y obtenga una buena calidad de oscilaciones theta espontáneas de potencial de campo local.