Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del trasplante y la preservación de órganos. Las aplicaciones de este método incluyen la prueba de perfusiones novedosas y aditivos de perfusión, la prueba de software diseñado para la evaluación de órganos y la realización de experimentos diseñados para reparar órganos. La principal ventaja de esta técnica es que el modelo de perfusión hepática normotérmica ex vivo que aquí se presenta es sencillo, fácilmente replicable, de bajo coste y tiene una amplia gama de aplicaciones.

Comience preparando el brazalete de portal de calibre 16. Corta una sección de tubo de cinco milímetros y determina el punto medio de la sección midiendo 2,5 milímetros. Haga una incisión en el punto medio y retire la mitad anterior del tubo.

Use un hemostático para triturar esta parte ahora plana. Use un encendedor para derretir el otro extremo del angiocatéter y crear un labio. A continuación, prepare la cánula del conducto biliar cortando el puerto de inyección de un angiocatéter de calibre 27, dejando solo el catéter.

Conéctelo a una sección de 10 centímetros de tubo de cánula de calibre 27. Coloque una rata anestesiada con la nariz en el cono de la nariz de anestesia y las cuatro extremidades inmovilizadas. Controle los signos vitales colocando el monitor en la extremidad posterior izquierda.

Realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar la profundidad adecuada de la anestesia. Rocíe el abdomen del animal con alcohol isopropílico al 70% y deje que se seque. Coloque una cortina estéril sobre el animal.

Luego, después de hacer una incisión en la línea media desde el xifoides hasta el pubis con unas tijeras afiladas, ingrese suavemente al peritoneo e incida el músculo. Extienda la incisión lateralmente hacia la izquierda y la derecha para formar una cruz a nivel del borde inferior del hígado. En este punto, baje la anestesia de isoflurano al 2%Retraiga el proceso xifoides con una pinza curva para mosquitos y las costillas con retractores de costillas.

Luego, use tijeras afiladas para cortar los ligamentos falciformes, frénicos y gastrohepáticos. Ubique y ate la vena frénica con una sutura 7-0 lo más cerca posible de su origen para evitar fugas. A continuación, usa un aplicador estéril de punta de algodón humedecido para eviscerar a la rata.

Envuelva el intestino en una gasa humedecida con solución salina normal al 0,9%, teniendo cuidado de no estirar la vasculatura. A continuación, diseccionar la vena cava inferior para eliminar el exceso de tejido. Diseccionar detrás de la VCI justo por encima de la bifurcación y pasar un asa de una sutura de seda 4-O para su uso posterior.

A continuación, retraiga el riñón derecho para proporcionar exposición a la vena suprarrenal derecha y retraiga el lóbulo derecho del hígado superiormente con una gasa. Amarre la vena suprarrenal derecha con una sutura de seda 7-0 lo más cerca posible de la VCI y cauterícela a través de ella distal a la ligadura. A continuación, disecciona cuidadosamente la vena esplénica.

Átalo con dos suturas de seda 7-0 y córtalo entre las dos suturas. Después de diseccionar alrededor de la arteria gastroduodenal, ate la arteria gastroduodenal con una sutura de seda 7-0 y un ligado. A continuación, diseccione alrededor de la arteria hepática y coloque sin apretar una atadura de sutura de seda 7-0 a su alrededor.

A continuación, disecciona el conducto biliar. A continuación, compruebe la longitud del conducto biliar, átelo en el extremo distal y coloque un asa de sutura alrededor del conducto biliar y proximalmente como sea posible. Use unas tijeras pequeñas para cortar un orificio que tenga la mitad del diámetro del conducto y coloque un catéter de calibre 27 en el conducto biliar proximalmente.

Ate el catéter en su lugar con una sutura de amarre de sandalia romana. A continuación, utilice una aguja de calibre 27 para inyectar 0,5 mililitros de heparina en la vena peneal o IVC. A continuación, pinza y amarre la VCI con la sutura de seda 4-0 colocada anteriormente y ate la arteria hepática con la sutura de seda 7-0 colocada anteriormente.

Ahora, use una pinza microquirúrgica para pinzar la vena porta. Cánula de la vena porta con un angiocatéter de calibre 22 y enjuagar con 60 mililitros de solución salina normal fría al 0,9% que contenga 100 unidades de heparina hasta que el hígado se blanquee. Después de lavar el hígado, exponga la VCI suprahepática y corte a través de ella lo más alto posible en el tórax.

Realice la hepatectomía cortando alrededor del diafragma y luego cortando la arteria hepática, la VCI, la vena porta y cualquier ligamento adicional. Levante el hígado y coloque una solución salina normal al 0,9% helada. Por último, coloque el manguito vascular de calibre 16 en la vena porta y conecte el hígado al circuito de perfusión hepática normotérmica ex vivo.

Antes de comenzar cada perfusión, se debe realizar una inspección visual del circuito para identificar y dañar o acumular en los componentes del circuito o en la tubería. Si hay acumulación de bacterias u otras sustancias en el circuito, las piezas deben reemplazarse o limpiarse. Comience por hacer fluir la perfusión a dos mililitros por minuto.

Observe el monitor para detectar cualquier aumento en la presión de la vena porta, ya que esto puede indicar que el vaso se ha ocluido y requiere una reposición de la cánula. Inserte la cánula de la vena protal en la vena porta con manguito para el flujo de retorno de la perfusión y la sutura con una sutura de seda 7-0. Una vez que ambas cánulas estén en su lugar, comience a aumentar el flujo de perfusión en un mililitro por minuto hasta alcanzar la presión fisiológica en el rango de 10 a 16 centímetros de agua.

Retirar muestras de un mililitro del pre-puerto y post-puerto durante la perfusión. Divida cada muestra de un mililitro en dos muestras de 0,5 mililitros. Congele una de las alícuotas de 0,5 mililitros en tubos criogénicos en nitrógeno líquido y realice un análisis de gases en sangre arterial utilizando los 0,5 mililitros restantes de perfusión.

A continuación, mida el pH y tampone la perfusión según sea necesario para volver a pH 7,4. Después de cuatro horas de perfusión, desconecte el hígado del circuito de perfusión. Divida el hígado en segmentos de 0,5 gramos, transfiéralo a tubos criogénicos y congélelo en nitrógeno líquido.

La ALT se midió a cero, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 minutos de perfusión. Hay significativamente menos ALT en el grupo de perfusión base más PEG-CAT en comparación con la perfusión base, que se muestra en negro a los 150, 180, 210 y 240 minutos. El ATP tisular se mantuvo en el grupo de perfusión de bases más PEG-CAT en comparación con el grupo de perfusión de bases solas.

La producción de MDA tisular fue significativamente mayor en el grupo de perfusión de base que en el grupo de perfusión de base más PEG-CAT. El GSH total se mantuvo en el grupo de perfusión base más PEG-CAT en comparación con el grupo de perfusión base sola. Cada aplicación propuesta de perfusión hepática normotérmica ex vivo deberá probarse metódicamente en modelos animales antes de ser probada en órganos humanos descartados y luego en hígados humanos.

El modelo presentado aquí es ideal ya que es fácilmente replicable, elimina las pruebas superfluas y es de bajo costo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ejecutar un modelo de perfusión hepática ex vivo normotérmico barato y fácilmente replicable utilizando ratas.