Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias
21 de septiembre de 2021
El protocolo presentado aquí permite la reproducción de una desmielinización generalizada de la materia gris de ambos hemisferios corticales en ratas agouti oscuras macho adultas. El método consiste en la implantación intracerebral de un catéter, la inmunización subclínica contra la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y la inyección intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias a través del catéter implantado.
El objetivo general de este procedimiento es generar una desmielinización generalizada de la corteza de ambos hemisferios cerebrales en un modelo de rata utilizando inmunización subclínica contra la glicoproteína oligodendrocitos de mielina, seguida de una inyección cerebral de citoquinas a través de un catéter implantado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en enfermedades inflamatorias desmielinizantes del cerebro, como la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que puede generar inflamación inducida por la desmielinización de la materia gris en la corteza de ambos hemisferios cerebrales sin dar lugar a tapones de materia blanca.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor comprensión de los mecanismos de desmielinización cortical que se observa principalmente en los tipos progresivos de esclerosis múltiple. Para comenzar este procedimiento, ensamble el catéter y la tapa del catéter con la entrada. A continuación, corte el catéter a una longitud de dos milímetros con un bisturí.
Luego afeite la cabeza de una rata anestesiada entre las orejas usando la afeitadora eléctrica. Coloque la rata en el marco estereotáctico y asegure su cabeza con las barras para los oídos y la placa de mordida. Asegúrese de que la cabeza esté horizontal y compruebe su estabilidad aplicando presión sobre ella con el dedo o las pórceps.
Después, aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía, cubra los ojos con un material opaco para evitar cualquier exposición a la luz quirúrgica. A continuación, limpie el área afeitada alternando la aplicación de 70% de etanol y 10% de complejo de yodo povidona. Para implantar el catéter, haga una incisión longitudinal de aproximadamente dos centímetros de longitud a lo largo de la línea media.
Luego use abrazaderas de bulldog para sostener la piel a los lados. Retire la sangre con un aplicador de punta de algodón. Después, retire el periostio, limpie el tejido con el aplicador de punta de algodón, exponga el cráneo y deje que se seque durante aproximadamente un minuto.
A continuación, identifique los puntos de referencia anatómicos, lambda, bregma y sutura medial. Con el taladro instalado en el marco estereotáctico, coloque la punta de la broca en el bregma como punto de partida. Muévase dos milímetros más atrás desde el bregma, y 2,4 milímetros lateralmente hasta la sutura medial.
Luego, perfore un orificio de 0,5 milímetros de diámetro para el catéter en esta posición. Perfore tres orificios más de 1,3 milímetros de diámetro para los tornillos de anclaje a unos milímetros del primer orificio. Retire el polvo óseo mediante irrigación con alrededor de uno o dos mililitros de PBS estéril y limpie el cráneo.
Posteriormente, apriete los tornillos de anclaje de dos a tres vueltas completas. Inserte un catéter de dos milímetros de longitud a través del primer orificio perpendicular a la superficie del cráneo. Mientras aún sostiene el catéter, aplique un poco de cemento dental y deje que polimerice con una breve exposición a la luz de curado dental para estabilizar el catéter.
Luego aplique más cemento dental alrededor del catéter, ancle los tornillos y solidifique el cemento dental con la luz de curado dental durante aproximadamente 15 a 30 segundos, confirme que el cemento esté endurecido. Después de la implantación, cierre la piel con suturas reabsorbibles anteriores y posteriores al catéter. Luego inyecte la mezcla de antídoto por vía subcutánea.
A continuación, administrar 2,5% de enrofloxacina mediante inyección subcutánea para el tratamiento antibiótico profiláctico. Devuelva al animal a la jaula modificada y manténgalo bajo observación durante una a tres horas con una aplicación de luz infrarroja para evitar la hipotermia. Repita el tratamiento con enrofloxacina y administre carprofeno a un miligramo por mililitro por vía subcutánea para aliviar el dolor mediante inyección el día después de la cirugía.
Para preparar la mezcla de inmunización, conecte dos jeringas de vidrio de punta de bloqueo inferior de 10 mililitros a los brazos cortos de una llave de paso de tres vías y cierre la tercera salida con el brazo largo. A continuación, pipetee un mililitro de IFA y 50 microgramos de rMOG juntos. Y ajustar la mezcla a un volumen final de dos mililitros con PBS estéril.
Coloque la mezcla diluida de IFA y rMOG en la jeringa abierta, luego inserte el pistón suavemente mientras mantiene una presión suelta en el pistón opuesto. Emulsiona el inóculo conduciendo de una jeringa a la otra empujando los pistones hacia adelante y hacia atrás hasta que esté blanco y viscoso. A continuación, fije una jeringa de bloqueo inferior de un mililitro al brazo corto abierto de la llave de paso de tres vías y llénelo con inóculo.
Distribuya todo el inóculo en jeringas de un mililitro y manténgalas en hielo hasta la inyección. Posteriormente, inyecte 200 microlitros de la mezcla IFA y rMOG por vía subcutánea en la base de la cola bajo anestesia temporal de isoflurano utilizando una aguja de calibre 21. Para la inyección de citoquinas intracerebrales, ajuste la longitud de la cánula del conector a dos milímetros.
Llene una jeringa de un mililitro con la mezcla de citoquinas. A continuación, conecte la jeringa a la cánula del conector. A continuación, llene la cánula con la mezcla de citoquinas, evite crear burbujas.
Luego, monte la jeringa en la bomba de jeringa programable y programe para inyectarla a una velocidad de 0.2 microlitros por minuto. Encienda la bomba y manténgala funcionando para evitar la formación de burbujas de aire en la punta de la cánula. Después, retire la tapa del catéter con la entrada.
Inserte la cánula del conector en el catéter, atornille y apriete. A continuación, permita que la inyección continúe durante 10 minutos antes de detener la bomba. Deje la cánula dentro del catéter durante 20 minutos para permitir que el volumen inyectado se difunda por completo.
Posteriormente, desenrosque la cánula del conector y retírela lentamente para evitar un efecto de vacío. Vuelva a colocar la tapa del catéter con la entrada y atornille. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula.
La desmielinización cortical podría evaluarse en diferentes puntos de tiempo después de una inyección de citoquinas por inmuno histoquímica para PLP. La Figura 6A muestra inmunorreactividad PLP intacta en el día 15 en un animal de control inmunizado con moggy que recibió solo PBS estéril a través del catéter implantado. El primer día después de la inyección de citoquinas, la desmielinización ya se pudo detectar en animales principales MOG.
Aunque, solo en las inmediaciones del área cateterizada. La inmunorreactividad de PLP permanece intacta en la corteza contralateral un día después de la inyección de citoquinas. En el tercer día, se pudo observar un aumento gradual en la pérdida de la inmunorreactividad PLP, que se propaga en la corteza ipsilateral.
La desmielinización cortical contralateral también podría detectarse en el tercer día, pero está bastante restringida al área debajo de los tornillos de anclaje. Entre los días nueve y 15, la desmielinización afecta a grandes partes de la corteza de ambos hemisferios. La desmielinización cortical se mantiene hasta 30 días después de la inyección de citoquinas en ambos hemisferios con solo una remielinización parcial.
La Figura 6J muestra una cuantificación de la pérdida de PLP en la materia gris cortical después de la inyección de citoquinas intracerebrales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar la desmielinización de la materia gris utilizando la inmunización subclínica contra las proteínas de mielina, seguida de la inyección intracerebral de citoquinas a través del catéter implantado. Este modelo animal podría ayudar a los investigadores en el estudio de los tipos progresivos de esclerosis múltiple, la desmielinización de la materia gris de capa es toda una marca.
El catéter implantado permite múltiples rondas de desmielinización o administración intercerebral de posibles fármacos terapéuticos sometidos a investigación preclínica sin causar trauma inducido por inyección.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para inducir desmielinización generalizada de la sustancia gris en la corteza de ambos hemisferios cerebrales en ratas macho adultas Dark Agouti. El método incluye inmunización subclínica contra la glicoproteína oligodendrocítica de la mielina y la inyección intracerebral de citocinas, con el objetivo de avanzar en la comprensión de enfermedades inflamatorias desmielinizantes como la esclerosis múltiple.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Deshielinización
- Enfermedades inflamatorias
Antecedentes
- Las metodologías actuales carecen de un medio para inducir desmielinización cortical sin causar lesiones en la sustancia blanca.
- Este protocolo proporciona información sobre los mecanismos de desmielinización cortical relevantes para enfermedades como la esclerosis múltiple.
- Tiene como objetivo mejorar la comprensión de la progresión de la enfermedad en trastornos desmielinizantes inflamatorios.
Objetivo del estudio
- Generar desmielinización inducida por inflamación en la sustancia gris mediante un modelo controlado en ratas.
- Investigar los mecanismos implicados en la desmielinización cortical, particularmente en la esclerosis múltiple progresiva.
- Desarrollar un método experimental confiable que evite complicaciones relacionadas con lesiones de la sustancia blanca.
Métodos Utilizados
- Implante intracerebral de un catéter para inyecciones dirigidas.
- Se utilizaron ratas macho adultas Dark Agouti como modelo biológico, centrándose en lesiones relacionadas con la desmielinización.
- Inmunización subclínica contra la glicoproteína oligodendrocítica de la mielina seguida de inyección intracerebral de citocinas.
- El método incluye pasos quirúrgicos y cronogramas específicos para asegurar el implante y tratamiento exitosos.
Resultados principales
- La inducción de desmielinización se confirmó mediante inmunohistoquímica para PLP, que mostró cambios corticales tempranos.
- Los efectos inmediatos de la inyección de citocinas provocaron desmielinización detectable poco después del procedimiento.
- El método resaltó la posibilidad de estudiar los mecanismos de desmielinización cortical sin cambios en el material blanco que dificultaran el análisis.
Conclusiones
- Este protocolo permite el estudio de los procesos de desmielinización cortical in vivo.
- Permite explorar enfoques terapéuticos para enfermedades como la esclerosis múltiple.
- Las implicaciones facilitan una mejor comprensión de las respuestas inflamatorias y la progresión de las enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el estudio de la desmielinización inducida por inflamación en la sustancia gris en un modelo de rata, abordando una laguna importante en la investigación de la esclerosis múltiple donde la patología de la sustancia gris está infrarrepresentada. Al evitar las lesiones de la sustancia blanca, el modelo proporciona una plataforma más específica para evaluar los mecanismos de desmielinización cortical relevantes para la EM progresiva. El enfoque facilita la evaluación preclínica de candidatos terapéuticos dirigidos a vías neuroinflamatorias con menos interferencias derivadas del daño en la sustancia blanca.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos inflamatorios que impulsan la desmielinización cortical en la materia gris.
- Valor operativo: Proporciona un modelo reproducible para validar dianas implicadas en las vías de desmielinización mediadas por citoquinas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantificables de desmielinización mediante inmunohistoquímica de PLP para la selección de compuestos.
- Valor operativo: El catéter implantado permite administraciones repetidas y evaluaciones longitudinales sin causar nuevo trauma quirúrgico.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Modela la desmielinización cortical observada en la EM progresiva, lo que apoya la validación de dianas relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Permite la administración intracerebral de agentes terapéuticos para evaluar la interacción con la diana y la eficacia en la sustancia gris.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, particularmente para programas centrados en neuroinflamación y desmielinización.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos de desmielinización inducidos por citoquinas en la sustancia gris cortical.
- Selección: Permite la administración estandarizada y repetible de compuestos mediante catéter para la evaluación de la relación dosis-respuesta.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de la pérdida de PLP para comparar condiciones y hacer un seguimiento de la progresión de la desmielinización.
- Investigación Traducional: Modela la patología de la sustancia gris relevante para la EM progresiva, apoyando la validación de dianas alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de catéter permite múltiples rondas de intervención, aumentando su utilidad en campañas de selección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar la desmielinización cortical de la patología de la sustancia blanca.
- Valor operativo: Procedimientos quirúrgicos y de inyección estandarizados mejoran la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción del desarrollo al proporcionar confianza predictiva en la modulación del blanco dentro de la sustancia gris.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapéuticos del sistema nervioso central basada en la modulación de la desmielinización cortical.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica e implantación de catéteres en modelos roedores.
- Depende de infraestructura quirúrgica estéril, cemento dental y bombas de jeringa programables para la administración de citocinas.
- Necesita estandarización entre los equipos para lograr una colocación consistente del catéter y dosificación de citocinas.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en la respuesta inmunitaria entre cepas de ratas y lotes de citocinas.
- Limitado a conocimientos mecanicistas preclínicos; no modela la fisiopatología completa de la esclerosis múltiple, incluyendo la infiltración de células inmunitarias o los ciclos de recaída-remisión.
