Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico, como si los micro ARN son biomarcadores válidos en las enfermedades cardiovasculares. En comparación con la PCR cuantitativa en tiempo real, la PCR digital exhibe cualidades técnicas superiores para cuantificar microARN en circulación. Como la muestra se divide en unas 20.000 gotas, no es necesario duplicar las mediciones y no se necesita una curva estándar para la cuantificación.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la cuantificación de microARN en pacientes cardiovasculares, también puede aplicarse a otros pacientes y enfermedades, ya que otros microARN se han mostrado prometedores como biomarcadores en la progresión del cáncer, también puede aplicarse a pacientes oncológicos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las gotas generadas son frágiles y deben manipularse con cuidado. Después de aislar el ARN de las muestras de suero, continúe con la transcripción inversa para obtener ADN complementario más estable para la dPCR.

Para empezar, descongela el kit de transcripción inversa con hielo. A continuación, gire las enzimas y los cebadores. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto.

Combine 10 microlitros de la mezcla maestra con cinco microlitros de ARN extraído en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 2.000 x g a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Proceda con la transcripción inversa como se detalla en el protocolo de texto.

Primero, descongele la mezcla comercial de dPCR, los cebadores de ADNc y PCR en hielo y centrifugue inmediatamente antes de usar. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto. Agregue volúmenes de 1,33 microlitros de producto de transcripción inversa a volúmenes de 18,67 microlitros de la mezcla maestra y centrifugue brevemente.

Con una pipeta, transfiera 20 microlitros de la muestra a cada pocillo de la fila de medio de un casete de ocho pocillos. A continuación, pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en los pozos de aceite del casete. A continuación, coloque una junta en la parte superior del casete y colóquela en el generador de gotas.

Cierre el generador de gotas y espere hasta que las tres luces indicadoras estén en verde fijo. Con una pipeta, transfiera con cuidado 40 microlitros de la muestra en forma de gota a pocillos separados de una placa de 96 pocillos. A continuación, selle la placa con una lámina dPCR a 180 grados centígrados durante cuatro segundos.

Coloque la placa PCR sellada en el ciclador y siga las instrucciones de ciclo descritas en el protocolo de texto. Retire la placa del termociclador y transfiérala a la base de un soporte de placas. A continuación, coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa PCR.

Por último, inicie el software comercial de dPCR. En este protocolo, se utilizó la PCR digital para cuantificar microRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular. Se tomaron muestras de 16 pacientes antes, ocho horas después y 16 horas después de la intervención percutánea.

Los pacientes con infarto de miocardio con elevación del segmento ST mostraron un aumento significativo en los niveles de miR-499 en comparación con los pacientes con enfermedad arterial coronaria estable. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora para la formación de gotas de 96 muestras si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que debe manipular las gotitas con cuidado.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la PCR digital correctamente, mediante la formación correcta de gotas, ciclos, lectura y análisis.