Name: Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprende a cuantificar microRNAs circulantes mediante PCR digital para biomarcadores de enfermedades cardiovasculares. Este protocolo valida miRNAs en suero de pacientes con infarto agudo de miocardio.

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Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

1. extracción de miRNA de suero, Plasma
Nota: Para cuantificar apropiadamente miRNAs, el aislamiento correcto microRNA del plasma/suero es un paso crucial. Una cosa fundamental a tener en cuenta, sobre todo porque existen diferentes protocolos, es seguir el mismo flujo de trabajo durante el procesamiento de las muestras. En este protocolo, miRNA se extrae de 50 μl de suero. No use más de 200 μL como este límite el proceso de extracción correcto.
<ol><li>Preparar suero o descongelar las muestras congeladas.</li>
	<li>Añadir 250 μl (5 volúmenes) de reactivo de lisis comercial a 50 μl de suero. Apoyar la lisis con un vórtex. Coloque el tubo con el lisado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Spike el lisado con 3.5 μl de spike en el control (1.6 x 107 copias/μL) y mezclar con un vórtex.</li>
	<li>Añadir 50 μl de cloroformo (es decir, una cantidad igual a la muestra a partir de suero) para la separación de fase. Agitar el tubo vigorosamente por 15 s. lugar el tubo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2-3 min.</li>
	<li>Para la separación de fases, centrifugar el tubo a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos. Nota: Las muestras se dividen ahora en una fase acuosa superior que contiene el ARN, una interfase blanco y una fase orgánica inferior, de color rosado.</li>
	<li>Transferir la fase acuosa superior (100 μL) que contiene el RNA en un tubo nuevo. No transferir cualquier material de interfase blanco esto falsea la correcta cuenta de RNA.</li>
	<li>Añadir 150 μL (es decir, 1.5 x el volumen de la muestra transferido) de etanol al 100%. Mezclar los materiales mediante pipeteo les hacia arriba y hacia abajo. No los Centrifugue y pasar rápidamente al siguiente paso.</li>
	<li>Pipetear 250 μl de la muestra en una columna de giro comercial en un tubo de recogida de 2 mL. Cierre la tapa. Centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. descarte el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 700 μl de buffer lava comercial 1 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón de lavado comercial 2 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.</li>
	<li>Pipetear 500 μl de etanol al 80% a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 2 minutos deseche el tubo de la colección con el flujo a través.</li>
	<li>Transferencia de la columna de spin a un tubo nuevo de colección de 2 mL. Centrifugar la columna a toda velocidad con una tapa abierta para secar la membrana. Deseche el tubo de la colección con el flujo a través.</li>
	<li>Transferir la columna de la vuelta a un nuevo tubo de recogida de 1,5 mL. Eluir el RNA aplicando 30 μl de agua libre de ARNasa directamente al centro de la membrana. Cierre la tapa. Centrifugar la columna a toda velocidad durante 1 minuto.</li>
	<li>Guardar el ARN a-70 ° C. Nota: El almacenamiento de ARN purificado en agua libre de ARNasa entre-70 ° C a-20 ° C no asegura la degradación del RNA durante 1 año. Siguiendo el protocolo del fabricante, la cantidad mínima de agua libre de ARNasa a diluir el ARN es de 10 μl. con menos de 10 μl escaso puede hidratar la membrana y reducir la producción de RNA total.</li>
</ol>2. transcripción reversa
Nota: El ADN complementario (cDNA) fue sintetizado utilizando el siguiente protocolo de transcripción inversa (RT) de 15 μl (volumen de reacción total).
<ol><li>Descongelar el kit de RT en el hielo. Mantenga las enzimas en el congelador tanto como sea posible para evitar de degradar y los hace girar hacia abajo antes de usar. Descongelar cartillas de RT en el hielo y los hace girar hacia abajo antes de usar.</li>
	<li>Preparar la mezcla principal como se describe en la tabla 1.</li>
	<li>Mezclar 10 μl de la mezcla principal y 5 μl del ARN extraído por pozo en una placa de 96 pozos.</li>
	<li>Centrifugar la placa bien a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.</li>
	<li>Utilizar el protocolo de ciclo térmico descrito en la tabla 2 para la transcripción inversa. Nota: Como se describe a continuación, cDNA puede directamente ser procesado en la máquina digital de la PCR (véase Tabla de materiales); Alternativamente, pueden ser almacenada a-20 ° C.</li>
</ol>3. gota generación y PCR Digital
Nota: Digital PCR se realizó utilizando el siguiente protocolo de 40 μl.
<ol><li>Descongelar la mezcla comercial dPCR, el cDNA preparado y los cebadores PCR en hielo. Centrifugue los poco antes de su uso.</li>
	<li>Preparar la mezcla principal como se describe en tabla 3.
</li>
	<li>Agregar 1.33 μL/pocillo del producto RT y centrifugar brevemente.</li>
	<li>Pipetear 20 μL de la muestra en cada pocillo de la cassette de 8 bien (fila media). Nota: Si el cassette 8-bien no está totalmente lleno, llenar los pozos restantes con plantilla no controles (NTSC) que omiten cDNA (es decir, el producto RT producido con agua en lugar de RNA extraído) o almacenador intermediario comercial dPCR. El CNT sirve como un control de la contaminación. Agua no debe utilizarse en los pozos restantes, ya afectará la calidad de la formación de gotas.</li>
	<li>Pipetee 70 μL del aceite de generación de gotas para las sondas en los pozos de petróleo (fila inferior) del cassette 8-bien.</li>
	<li>Colocar una junta en la parte superior del cartucho 8-bien y coloque el cartucho en el generador de gotas. Cierre el generador de gotas. Espere hasta que los 3 indicadores luminosos son de color verde. Nota: Las gotas se están generando ahora.</li>
	<li>Cuidadosamente y lentamente transferencia 40 μL de la muestra gota-formado (fila superior) en pocillos distintos de una placa de 96 pocillos mediante pipeteo.</li>
	<li>Después de completar la formación de gotas en las muestras, sellar la placa PCR con una hoja de dPCR perforable a 180 ° C para 4 s.</li>
	<li>Coloque la placa de PCR papel sellado en el cycler y ciclo tal como se describe en la tabla 4, a una tasa de rampa de 2.5 ° C/s.</li>
</ol>4. gotita lectura y análisis de
<ol><li>Transferir la placa del termociclador a la base del soporte de la placa. Ajuste la placa PCR mediante la colocación de la parte superior del porta placa en la placa de la polimerización en cadena.</li>
	<li>Inicie el software de dPCR comercial.</li>
	<li>Introduzca el nombre de la muestra, el nombre del experimento y el objetivo en el programa de instalación. Seleccione la cuantificación absoluta.</li>
	<li>Iniciar la gota de lectura haciendo clic en Ejecutar. Seleccione FAM/HEX o FAM/VIC como química de detección con sondas de hidrólisis. Nota: El software comercial dPCR entonces auto-analizar los datos.</li>
	<li>Compruebe el número de gotas en la tabla de resultados para asegurar una generación correcta gota.</li>
	<li>Seleccione todos los pozos con el mismo miRNA cuantificado y haga clic en analizar. Utilice el blot 2D gotas positivas y corregir manualmente los datos de auto-análisis (figura 1).</li>
</ol>5. corregir los cálculos sobre la muestra
<ol><li>Normalizar la muestra multiplicando la muestra por el factor de normalización (NF). NF = mediana [C. elegans miR-39 mediciones]todas las muestras/ [C. elegans miR-39]muestra
</li>
	<li>Calcular la concentración de suero de miRNA final, ajuste para los factores de dilución (DF). [miRNA] final = [miRNA]valor crudo x DFRT x DFdPCR x DFEx Donde: [miRNA] valor bruto = miRNA cuantificado por software comercial dPCR; DFRT = factor de dilución de la plantilla en reversa de la transcripción; DFdPCR = factor de dilución de la plantilla de dPCR; DFEx = el factor de dilución en la extracción.</li>
</ol>6. serie de diluciones de oligonucleótidos sintéticos
<ol><li>Descongelar el oligonucleótido sintético liofilizado en hielo. Centrifugar brevemente lo.</li>
	<li>Diluir el liofilizado oligonucleótidos sintéticos en agua libre de nucleasa para una concentración final de 10 pmol / μl. brevemente Centrifugue lo.</li>
	<li>Diluir en agua libre de nucleasa como se describe en la tabla 5. Centrifugue la dilución brevemente entre cada paso de dilución a 8.000 x g durante 10 s.</li>
	<li>Continuar con la transcripción inversa como se describe en el paso 2 y analizar las muestras con la PCR digital tal como se describe en el paso 3 y paso 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
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<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

PCR digital es un método relativamente novedoso punto final de la PCR que permite la cuantificación absoluta directa de ácidos nucleicos dentro de una muestra. El método posee ventajas particulares, incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día y una sensibilidad superior11,12. Además, debido a la partición de la muestra en aproximadamente 20.000 solo reacciones y análisis de punto final, dPCR es más robusto a substancias que interf...

Circulación miRNAs se han identificado como marcadores promisorios para un número de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares1. Los miRNAs son pequeñas, moléculas de ARN monocatenario no codificante (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) están implicadas en la regulación postranscripcional mediante la alteración de la traducción del ARN mensajero y que influencia gene expression2, y son liberados a la circulación en los Estados fisiológicos y patológicos. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede ser vinculada a la patología, y algunos miRNAs tejido alta y especificidad de la enfermedad1. En las enfermedades cardiovasculares, miRNAs se han convertido en candidatos atractivos como nuevos biomarcadores porque son notablemente estables en el suero y puede ser cuantificada con la ayuda de la metodología PCR3. El valor potencial de miRNAs como biomarcadores para infarto de miocardio ha sido evaluado en estudios pequeños, pero carece de una validación en cohortes grandes2. Por ejemplo, miR-499 se encuentra altamente expresada en el músculo miocardio, y se ha demostrado para ser aumentada significativamente en un AMI4,5,6. Además, regula programada muerte celular (apoptosis) y la diferenciación de los cardiomiocitos y así participa de varios mecanismos después de una IAM7. Aparte de algunos pequeños estudios reportando un valor incremental de miRNAs para el diagnóstico de IAM y superioridad, la superioridad o igualdad de troponinas cardiacas de alta sensibilidad no todavía ha probado en estudios de gran escala2,5 ,6,8. Más estudios prospectivos de cohortes grandes son, por lo tanto, necesarios para evaluar el valor potencial de diagnóstico de miRNAs. Además, métodos de cuantificación de miRNA necesitan ser optimizados y estandarizados usando comparables protocolos9. Ensayos estandarizados pueden reducir resultados inconsistentes y los miRNAs para convertirse en potenciales biomarcadores para el uso clínico rutinario, como biomarcadores deben ser cuantificados de una manera reproducible para asegurar su aplicabilidad clínica.
Recientemente, se ha introducido dPCR como un análisis de punto final. Divide la muestra en aproximadamente 20.000 reacciones individuales10. El sistema de dPCR entonces utiliza un Poisson estadístico análisis matemático de señales fluorescentes (reacciones positivas y negativas), lo que permite una cuantificación absoluta sin una curva estándar10. Cuando se combinan dPCR con sondas fluorescentes de hidrólisis, es posible la cuantificación absoluta directa altamente específica de miRNAs. Reacción en cadena de polimerasa digital ha demostrado exhibir cualidades técnicas superiores (incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día, un alto grado de linealidad y una alta sensibilidad) para cuantificar los niveles de miRNA en el circulación en comparación con la PCR en tiempo real cuantitativa10,11. Estas cualidades técnicas superiores podrían ayudar a mitigar las limitaciones actuales en el uso de circulación miRNAs como biomarcadores y pueden conducir al establecimiento de miRNAs como biomarcadores en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros y como método de diagnóstico en general. En un estudio anterior, recientemente aplicada dPCR la cuantificación absoluta de miRNAs en pacientes con un IAM de circulación y fueron capaces de demostrar el potencial diagnóstico superior en comparación con la cuantificación de miRNAs por qPCR12.
En esta publicación, queremos demostrar que el uso de dPCR es un método preciso y reproducible para cuantificar directamente la circulación cardiovascular miRNAs. La cuantificación absoluta de miRNA niveles en suero, utilizando PCR digital, muestra potencial para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación Describimos detalladamente cómo realizar con eficacia la PCR digital y cómo detectar el número de copia absoluto miRNA en suero.

<table><tbody><tr><td><Extracción >ARN</Kit ></td> suero/<td></td><td></td><td></td>plasma fácil</tr> (<tr><td>50)</td><td>Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Alemania</td><td>217184</td><td>Kit para la extracción de microARN. El kit contiene tampón comercial RWT (llamado número uno en el manuscrito)&nbsp; y RPE (llamado número dos en el manuscrito).</td></tr><tr><td>miRNeasy Suero/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol</td><td>Qiagen-Muestra & Assay Technologies, Hilden, Alemania</td><td>219610</td><td>Espiga para normalización, Secuencia: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'<</td></tr><tr><td>strong>Reverse Transcription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td>. <td>Kit de 4366597 para transcripción inversa de microARN</td><td></td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td><td>. 4440887</td><td>Ensayos utilizados en transcripción inversa</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td><td>. 4440887</td><td>Número de ensayo 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td>. <td>Número de</td><td>ensayo 4440887 000200</td></tr><tr><td>Placa de PCR, 96 pocillos, segmentado, semifaldón</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>AB0900</td><td>Placa de 96 pocillos para transcripción inversa</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; sellos</td><td>Sellos Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td></td><td>MSB1001 Lámina para garantizar un almacenamiento adecuado</td></tr><tr><td>C1000 Termociclador</td> táctil <td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>1851196</td><td>Cycler utilizado para transcripción inversa</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>personalizadas</td><td>Secuencia: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix para sondas (No dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 1863024</td><td>Supermix utilizada en la generación de gotas</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td><td>. 4440887</td><td>Assays utilizados en PCR digital (sonda de hidrólisis fluorescente)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td><td>.</td><td>4440887 Número de ensayo 001352, cebadores comerciales</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU</td><td>. 4440887</td><td>Número de ensayo 000200, cebadores comerciales</td></tr><tr><td>DG8 Cartuchos y juntas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>El cartucho 1864007 toma hasta 8 muestras para la generación de gotas</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho DG8 Soporte</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.</td><td>1863051</td><td>Sostiene cartuchos en generación de gotas Generación de gotas</td></tr><tr><td>Aceite para sondas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 1863005</td><td>Aceite utilizado en la generación de gotas</td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 12001925</td><td>Placa de 96 pocillos para ddPCR</td></tr><tr><td>Placa de PCR Termosellado, lámina, perforable</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.</td><td>1814040</td><td>Lámina perforable, compatible con el lector de gotas</td></tr><tr><td>ddPCR Aceite</td><td>lector de gotas Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>1863004</td><td>Aceite utilizado en la lectura de gotas</td></tr><tr><td>Generador de gotas QX100 o QX200 Bio-Rad</td><td>Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>1863002</td><td>Generador de gotas, genera las gotas a partir de la emulsión de muestra/aceite</td></tr><tr><td>PX1 PCR Sellador de placas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>1814000</td><td>Sella la placa antes de PCR</td></tr><tr><td>C1000 Termociclador</td> táctil <td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 1851196</td><td>Ciclador utilizado para ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 1863003</td><td>Lee las gotas positivas y negativas para PCR con un detector óptico</td></tr><tr><td>Control de tampón ddPCR para sondas</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 1863052</td><td>Control de blanco&nbsp; y para llenar los pocillos restantes de cassette de 8 pocillos</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU</td>. <td></td><td>1864011 Programa para la lectura de gotas</td></tr><tr><td>Prisma Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU</td><td></td>. <td>Programa de análisis estadístico</td></tr></tbody></table>

digital pcr para cuantificar la circulación micrornas en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulación del suero microRNAs (miRNAs) han demostrado promesa como biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y el infarto agudo de miocardio (IAM), siendo liberado de las células cardiovasculares a la circulación. Circulación miRNAs son muy estables y pueden cuantificarse. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede vincularse con la patología y algunos miRNAs Mostrar tejido alta y especificidad de la enfermedad. Búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares es de importancia para la investigación médica. Recientemente, se ha inventado la reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica. dPCR exhibe cualidades técnicas superiores, incluyendo una baja variabilidad, alta linealidad y alta sensibilidad en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Así, la dPCR es un método más exacto y reproducible para cuantificar directamente el miRNAs, particularmente para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación describimos cómo realizar efectivamente la PCR digital para evaluar el número de copia absoluta en muestras de suero.

PCR digital combinado con sondas fluorescentes de hidrólisis permite a los investigadores cuantificar directamente las cantidades absolutas de miRNAs específicos en copias/μl. Como la muestra de dPCR se reparte en reacciones de PCR individuales aproximadamente 20.000, dPCR no requiere técnica Replica10. El sistema de dPCR utiliza un análisis estadístico matemático de Poisson de señales fluorescentes (diferencia entre las reacciones positivas y negativas) que permit...

MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico, como si los micro ARN son biomarcadores válidos en las enfermedades cardiovasculares. En comparación con la PCR cuantitativa en tiempo real, la PCR digital exhibe cualidades técnicas superiores para cuantificar microARN en circulación. Como la muestra se divide en unas 20.000 gotas, no es necesario duplicar las mediciones y no se necesita una curva estándar para la cuantificación.Aunque este método puede proporcionar información sobre la cuantificación de microARN en pacientes cardiovasculares, también puede aplicarse a otros pacientes y enfermedades, ya que otros microARN se han mostrado prometedores como biomarcadores en la progresión del cáncer, también puede aplicarse a pacientes oncológicos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las gotas generadas son frágiles y deben manipularse con cuidado. Después de aislar el ARN de las muestras de suero, continúe con la transcripción inversa para obtener ADN complementario más estable para la dPCR.Para empezar, descongela el kit de transcripción inversa con hielo. A continuación, gire las enzimas y los cebadores. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto.Combine 10 microlitros de la mezcla maestra con cinco microlitros de ARN extraído en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 2.000 x g a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Proceda con la transcripción inversa como se detalla en el protocolo de texto.Primero, descongele la mezcla comercial de dPCR, los cebadores de ADNc y PCR en hielo y centrifugue inmediatamente antes de usar. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto. Agregue volúmenes de 1,33 microlitros de producto de transcripción inversa a volúmenes de 18,67 microlitros de la mezcla maestra y centrifugue brevemente.Con una pipeta, transfiera 20 microlitros de la muestra a cada pocillo de la fila de medio de un casete de ocho pocillos. A continuación, pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en los pozos de aceite del casete. A continuación, coloque una junta en la parte superior del casete y colóquela en el generador de gotas.Cierre el generador de gotas y espere hasta que las tres luces indicadoras estén en verde fijo. Con una pipeta, transfiera con cuidado 40 microlitros de la muestra en forma de gota a pocillos separados de una placa de 96 pocillos. A continuación, selle la placa con una lámina dPCR a 180 grados centígrados durante cuatro segundos.Coloque la placa PCR sellada en el ciclador y siga las instrucciones de ciclo descritas en el protocolo de texto. Retire la placa del termociclador y transfiérala a la base de un soporte de placas. A continuación, coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa PCR.Por último, inicie el software comercial de dPCR. En este protocolo, se utilizó la PCR digital para cuantificar microRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular. Se tomaron muestras de 16 pacientes antes, ocho horas después y 16 horas después de la intervención percutánea.Los pacientes con infarto de miocardio con elevación del segmento ST mostraron un aumento significativo en los niveles de miR-499 en comparación con los pacientes con enfermedad arterial coronaria estable. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora para la formación de gotas de 96 muestras si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que debe manipular las gotitas con cuidado.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la PCR digital correctamente, mediante la formación correcta de gotas, ciclos, lectura y análisis.

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A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

El modelo de rata con infarto agudo de miocardio (IAM) es útil para estudiar las consecuencias de un infarto de miocardio en la función cardíaca fisiopatológicos y fisiológicos.

Infarto agudo de miocardio en ratas

Aprende a cuantificar microRNAs circulantes mediante PCR digital para biomarcadores de enfermedades cardiovasculares. Este protocolo valida miRNAs en suero de pacientes con infarto agudo de miocardio.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

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