Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares
3 de julio de 2018
MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del diagnóstico, como si los micro ARN son biomarcadores válidos en las enfermedades cardiovasculares. En comparación con la PCR cuantitativa en tiempo real, la PCR digital exhibe cualidades técnicas superiores para cuantificar microARN en circulación. Como la muestra se divide en unas 20.000 gotas, no es necesario duplicar las mediciones y no se necesita una curva estándar para la cuantificación.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la cuantificación de microARN en pacientes cardiovasculares, también puede aplicarse a otros pacientes y enfermedades, ya que otros microARN se han mostrado prometedores como biomarcadores en la progresión del cáncer, también puede aplicarse a pacientes oncológicos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las gotas generadas son frágiles y deben manipularse con cuidado. Después de aislar el ARN de las muestras de suero, continúe con la transcripción inversa para obtener ADN complementario más estable para la dPCR.
Para empezar, descongela el kit de transcripción inversa con hielo. A continuación, gire las enzimas y los cebadores. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto.
Combine 10 microlitros de la mezcla maestra con cinco microlitros de ARN extraído en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 2.000 x g a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Proceda con la transcripción inversa como se detalla en el protocolo de texto.
Primero, descongele la mezcla comercial de dPCR, los cebadores de ADNc y PCR en hielo y centrifugue inmediatamente antes de usar. A continuación, prepare la mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto. Agregue volúmenes de 1,33 microlitros de producto de transcripción inversa a volúmenes de 18,67 microlitros de la mezcla maestra y centrifugue brevemente.
Con una pipeta, transfiera 20 microlitros de la muestra a cada pocillo de la fila de medio de un casete de ocho pocillos. A continuación, pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en los pozos de aceite del casete. A continuación, coloque una junta en la parte superior del casete y colóquela en el generador de gotas.
Cierre el generador de gotas y espere hasta que las tres luces indicadoras estén en verde fijo. Con una pipeta, transfiera con cuidado 40 microlitros de la muestra en forma de gota a pocillos separados de una placa de 96 pocillos. A continuación, selle la placa con una lámina dPCR a 180 grados centígrados durante cuatro segundos.
Coloque la placa PCR sellada en el ciclador y siga las instrucciones de ciclo descritas en el protocolo de texto. Retire la placa del termociclador y transfiérala a la base de un soporte de placas. A continuación, coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa PCR.
Por último, inicie el software comercial de dPCR. En este protocolo, se utilizó la PCR digital para cuantificar microRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular. Se tomaron muestras de 16 pacientes antes, ocho horas después y 16 horas después de la intervención percutánea.
Los pacientes con infarto de miocardio con elevación del segmento ST mostraron un aumento significativo en los niveles de miR-499 en comparación con los pacientes con enfermedad arterial coronaria estable. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora para la formación de gotas de 96 muestras si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que debe manipular las gotitas con cuidado.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la PCR digital correctamente, mediante la formación correcta de gotas, ciclos, lectura y análisis.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para la extracción y cuantificación de microARN circulantes como posibles biomarcadores de enfermedades cardiovasculares. Mediante el uso de PCR digital, el método busca mejorar la precisión en la medición de microARN en muestras de suero de pacientes con afecciones cardiovasculares.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Enfermedad cardiovascular
- Biomarcadores
- Análisis de microARN
Antecedentes
- Los microARN son pequeños ARN no codificantes implicados en la regulación génica.
- Se han convertido en posibles biomarcadores para diversas enfermedades, incluidas las afecciones cardiovasculares.
- La PCR digital ofrece ventajas frente a los métodos tradicionales para la cuantificación de microARN.
- El conocimiento de los perfiles de ARNm puede ayudar en el diagnóstico y manejo de las enfermedades cardiovasculares.
Objetivo del estudio
- Validar los microARN como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares.
- Demostrar la eficacia de la PCR digital en la cuantificación de microARN circulantes.
- Proporcionar un protocolo confiable para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Extracción de miARNs de muestras de suero.
- Transcripción inversa para sintetizar ADN complementario.
- PCR digital para la cuantificación absoluta de miARNs.
- Comparación de la PCR digital con la PCR cuantitativa en tiempo real.
Resultados principales
- La PCR digital demostró una precisión superior en la cuantificación de miARN.
- El método permite el análisis de miles de gotas sin necesidad de curvas patrón.
- La aplicabilidad potencial del método se extiende más allá de las enfermedades cardiovasculares a otras afecciones como el cáncer.
- Se observaron desafíos en el manejo de gotas frágiles para los nuevos usuarios de la técnica.
Conclusiones
- El estudio respalda el uso de microARNs circulantes como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares.
- La PCR digital es una herramienta prometedora para la cuantificación precisa de miARNs.
- Investigaciones futuras podrían ampliar la aplicación de este método a otras enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de microARN circulantes mediante PCR digital ofrece un enfoque reproducible y de alta sensibilidad para la validación de biomarcadores en la investigación de enfermedades cardiovasculares. Este método apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos al permitir la cuantificación absoluta sin curvas patrón, reduciendo la variabilidad en estudios multicéntricos. La técnica mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular la expresión de microARN con la patología, aportando información para decisiones de continuar o descartar hipótesis terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de miARN específicos de la enfermedad, como el miR-499 en el IAM.
- Valor operativo: Proporciona números absolutos de copias de miARN sin necesidad de curvas patrón, mejorando la reproducibilidad entre centros.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras basada en biomarcadores al relacionar los niveles de miARN con la patología cardiovascular.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados (cDNA a partir de ARN sérico) para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Valor operativo: Proporciona resultados con alta linealidad y baja variabilidad, adecuados para la estandarización de ensayos.
- Escalabilidad: Permite el procesamiento de 96 muestras en aproximadamente una hora una vez dominado, lo que apoya el cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta la cuantificación de miARN en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante biomarcadores relevantes en suero para la enfermedad.
- Reducción de Ambigüedad Mecanística: Disminuye la incertidumbre en la validación del blanco al correlacionar la expresión de miARN con lesión cardiovascular.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante la cuantificación de miARN con alta especificidad tisular y de enfermedad.
Integración de la Secuencia de Trabajo y el Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, proporcionando datos cuantitativos de ARNmi que informan sobre la confianza en el blanco y la preparación del ensayo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de la liberación de miARN por células cardiovasculares hacia la circulación.
- Detección: Genera salidas estandarizadas listas para ensayos, con alta sensibilidad para la evaluación de candidatos a biomarcadores.
- Análisis: Permite la comparación directa de niveles de miARN entre diferentes condiciones mediante cuantificación absoluta sin curvas patrón.
- Investigación Traslacional: Promueve la continuidad del biomarcador al vincular los perfiles de miARN circulantes con la patología cardiovascular.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de cuantificación reutilizable aplicable en indicaciones cardiovasculares y oncológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validez del biomarcador mediante la cuantificación de miARN con baja variabilidad y alta sensibilidad.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y la estandarización mediante la partición basada en gotas, eliminando mediciones duplicadas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la ambigüedad mecanicista en las relaciones entre biomarcadores y dianas.
- Impacto en la cartera: Permite el avance ajustado al riesgo mediante datos cuantitativos de miARN vinculados a la patología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento de ARN, transcripción inversa y manipulación de gotas para prevenir la pérdida de muestra.
- Necesita equipos para la generación de gotas, termocicladores para PCR y software de dPCR para una cuantificación precisa.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de formación y sellado de gotas para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicarse a tipos de muestras distintas del suero, como plasma o lisados tisulares.
- Presenta limitaciones prácticas, como la manipulación delicada de las gotas, lo que puede afectar el rendimiento en usuarios inexpertos.
