Name: Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprende un protocolo in vitro de terapia fotodinámica para estudiar la apoptosis celular mediante fotosensibilizadores e irradiación con luz azul. Este método permite optimizar parámetros terapéuticos y evaluar su eficacia en cáncer de piel.

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Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

1. preparación de las células
<ol><li>Placa de 20.000 células en 2 mL de medio de cultivo en cada pocillo de una placa de 6 pozos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Colocar placas de 6 pocillos en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO2) durante 24 h permitir que las células se adhieren a las placas.</li>
</ol>2. preparación del fotosensibilizador para el tratamiento de las células
<ol><li>Preparar soluciones de 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA en medio de cultivo. Si el suero bovino fetal (FBS) es un ingrediente del medio de cultivo, preparar y tratar las células con 5-ALA en la solución de medio de cultivo con 0,1% FBS para incubaciones. 11 , 12 en este caso, las células SCC-13 no requieren FBS, así 5-ALA fue añadido directamente a queratinocitos medio libre de suero suplementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con al menos 2 mL de tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Aspire PBS y añadir 2 mL de las soluciones de 5-ALA 0, 0,5, 1 o 2 mM en placas separadas o pozos.</li>
	<li>Incubar las células con 0, 0.5, 1 o 2 mM 5-ALA en una 36 a 37 ° C calefacción bloque 30 min proteger las células de la exposición a la luz durante la incubación con papel de aluminio.</li>
	<li>Las soluciones de 5-ALA 0, 0.5, 1 y 2 mM de aspirar y lavar las células con 2 mL de PBS.</li>
	<li>Aspire PBS y añadir 2 mL de medio de cultivo para la irradiación de la luz azul.</li>
</ol>3. azul fototerapia luz
<ol><li>Antes de irradiar las células, activar el aparato de luz azul (p. ej., diodo emisor de luz, fluorescente o halógena) y duración de un ciclo (1.000 s) para calentar el dispositivo. El dispositivo de luz azul debería tener una longitud de onda de salida de 417 +/-5 nm. Permitiendo que el dispositivo funcione durante un ciclo antes de tratamientos se asegura que la longitud de onda de luz azul y la irradiación son constantes a lo largo de la fase de fotoactivación.</li>
	<li>Utilice un fotómetro para medir la irradiancia en la superficie celular. La irradiación de luz azul en la superficie de la célula debe ser 10 mW/cm2. La distancia entre la luz y las células deba ajustarse para lograr una radiación de 10 mW/cm2 según la intensidad de la fuente de luz.</li>
	<li>Coloque grupos de tratamiento ALA 0, 0.5, 1 y 2 mM sobre una superficie negra debajo de la fuente de luz azul. Irradian las células con luz azul para 1.000 s (16 min y 40 s) para un fluence total de 10 J/cm2. Después de la fotoactivación luz azul, las células están listas para análisis.</li>
</ol>4. colección y tinción
<ol><li>Preparar el búfer de flujo según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo y lavado las células con 2 mL de PBS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA y permiten separar por aproximadamente 3 a 5 min de las células. Las células pueden ser examinadas bajo el microscopio para confirmar la separación de la célula.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio de cultivo (o PBS) con 10% suero fetal bovino para desactivar la tripsina.</li>
	<li>Recoja la suspensión celular en tubos de flujo etiquetado 5 mL.</li>
	<li>Girar el tubo de flujo de 5 mL en una centrifugadora a 201 x g por 5 min aspirar solución sin remover el sedimento celulares.</li>
	<li>Agregar 200 μL de tampón de flujo con anticuerpo conjugado de annexin-V (1 μl de annexin-v por 39 μl de tampón de flujo) para cada muestra.</li>
	<li>Resuspender las células y en la incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 20 min permitir la Unión de la anexina V.</li>
	<li>Agregar 3 μl de 7-AAD a cada muestra. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. el análisis cytometric del flujo de
<ol><li>Siga instrucciones de fabricante de citómetro de flujo para la disposición (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Recoger y analizar muestras con citometría de flujo. 13
</li>
	<li>Realizar una comparación estadística de los grupos de tratamiento y control mediante análisis de varianza (ANOVA)14. Comparar las medias de los grupos de tratamiento a la media del control con la prueba de Dunnett para análisis post hoc .</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
<li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li>
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<li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris%3A+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice%3A+Part+I.+Acne+vulgaris%3A+When+and+why+consider+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li>
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<li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5650/annexin-v-and-propidium-iodide-labeling">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
<li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm403505s">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li>
<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/Sun farmacéutica proporciona 5-ALA y el dispositivo de luz BLU-U. Este manuscrito fue apoyado por residual de Dr. Jagdeo financiación. Los contenidos no representan las opiniones del Departamento de Asuntos Veteranos de Estados Unidos o el gobierno de Estados Unidos.

Hubo un aumento significativo en la apoptosis de SCC-13 tras incubaciones de 30 min 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA siguieron por 1.000 s de luz azul. Estos resultados son consistentes con nuestra investigación previamente publicado demostrando que incubaciones de 5-ALA de 30 min, seguida de activación luz azul conduce a un aumento dosis dependiente en el porcentaje de fibroblastos células que experimentan apoptosis12, 14.
Este enfoque experimental para estudiar PDT tiene ventajas y limitaciones. Los métodos descritos se ajustan a la práctica clínica como un PS comercialmente disponible y se utilizaron fuente de luz. Los investigadores pueden personalizar los métodos con diferentes tipos de células, PSs, fuentes de luz y parámetros de la irradiación. Sin embargo, existen limitaciones a este enfoque como este protocolo está diseñado para células adherentes en una monocapa. En la práctica clínica, las diferencias en arquitectura o enfermedad patología del tejido (es decir, hiperqueratosis o fibrosis) pueden disminuir la absorción de PS o penetración15. Como resultado, las dosis de tratamiento y los resultados experimentales no directamente correspondan a la práctica clínica. Modelos de tumores esferoide y chip de microfluidos se han estudiado métodos para replicar más de cerca tumor microambientes16,17,18. Esferoides tienen nichos celulares internas y externas que pueden incorporar el photosensitizers diferencialmente y representan arquitectura tumor heterogéneo. Otros investigadores han utilizado chips microfluídicos para condiciones de tratamiento de la pantalla y suministro vascular de photosensitizers. Sin embargo, chips microfluídicos pueden ser costosos de desarrollar o difícil de aplicar para los investigadores que no estén familiarizados con la técnica. Además, esferoides y chips microfluídicos pueden no reflejar el tratamiento clínico de los cánceres de piel en la cual photosensitizers se aplican directamente a la superficie del tumor sin diseminación vascular. Los investigadores deben evaluar los pros y contras de la cultura de monocapa, modelos de tumores esferoide y chips microfluídicos para estudiar PDT en sistemas diferentes de enfermedades. Como no existen células inmunes o matriz extracelular, no es posible determinar cómo afecta a la PDT las interacciones célula-célula compleja. Los investigadores deba confirmar en vitro resultados experimentales utilizando modelos animales y ensayos clínicos. Para lograr alta validez de la prueba, es importante mantener la incubación constante y luz de parámetros al realizar experimentos en vitro PDT.
Temperatura se sabe que alteran la eficacia de la PDT19. Un estudio demostró que la muerte celular, absorción del 5-ALA, PP IX formación y liberación de citoquinas pueden mejorar incubando células con 5-ALA en temperaturas hasta 44 ° C19. Temperatura de incubación superior a 44 ° C puede llevar a la muerte celular inducida por termales, y temperaturas de incubación por debajo de 20 ° C no pueden llevar a la absorción significativa de 5-ALA y acumulación19. Se recomienda que los investigadores realizan incubaciones de PS en un bloque de calefacción regulable en temperatura en una temperatura constante con control de confusión potencialmente efectos térmicos. Además, es importante incubar el fotosensibilizador para una cantidad suficiente de tiempo para permitir la conversión de 5-ALA en PP-IX. En este protocolo, se incubaron las células SCC-13 con 5-ALA durante 30 minutos, que con éxito indujo la apoptosis de las células. Previamente hemos demostrado que una incubación de 10 min de 5-ALA no aumentó significativamente la apoptosis en el fibroblasto en comparación con el control sin tratar fibroblastos11,14. PP-IX empieza a acumular en la piel del ratón después de 5-ALA es incubar durante 6 minutos a 37 ° C. Por lo tanto, después de diez minutos de incubación de 5-ALA, puede no haber suficiente acumulación de PP-IX para inducir la apoptosis de la célula20. Se recomienda un período de incubación mínimo de 20 a 30 min de 5-ALA basado en nuestros anteriores estudios11,14. Los investigadores deben optimizar el período de incubación basado en el laboratorio de ajuste, fotosensibilizador de interés, tipo de la célula y la indicación clínica. Experimentos de optimización y valoración de anticuerpos pueden realizarse para obtener mejores resultados utilizando las directrices de los fabricantes. Otros ensayos de interés pueden realizarse después de la fotoactivación luz azul incluyendo cuantificación de citometría de flujo dihydroethidium de ROS. 14
Variación en la cantidad de luz entregada por unidad de superficie (es decir, radiación) y dosis total de irradiación (es decir, fluence) durante la fase de fotoactivación pueden afectar la formación de ROS y de la célula apoptosis21. La relación entre la fluencia, irradiancia y tiempo puede ser descrita por la siguiente ecuación:
Fluencia (J/cm2) = irradiancia (W/cm2) x tiempo (s)
Como fluence es dependiente en el tiempo, alargando o acortando las fases de fotoactivación puede cambiar la eficacia del tratamiento. La radiación es proporcional a la distancia al cuadrado entre la fuente de luz y el tejido diana. Como resultado, si la luz está demasiado lejos, puede no haber suficiente energía de la luz entregado a los tejidos específicos para excitar el PS. alternativamente, se puede aumentar la irradiación por la luz que refleja de las superficies que rodean. Por lo tanto, se recomienda realizar irradiaciones de luz con las placas de cultivo celular colocadas sobre una superficie negra para evitar la reflexión de la luz. Los investigadores pueden adquirir comercialmente disponibles o aprobados por la FDA azul diodos emisores de luz y dispositivos fluorescentes para utilizar en experimentos de PDT, pero estos dispositivos tienen diferentes potencias y uniformidad de campo de la luz. Un fotómetro de longitud de onda específica debe utilizarse para medir la irradiancia en la superficie de la célula y la uniformidad del campo ligero antes de cada experimento para obtener resultados consistentes. Un difusor disponible comercialmente puede utilizarse para mejorar la uniformidad del campo, si es necesario.
En Resumen, hemos descrito un enfoque en vitro a investigar PDT por detalle teoría, métodos experimentales, limitaciones, peligros potenciales y las recomendaciones para la optimización. PDT es que una investigación clínica útil del procedimiento y en vitro puede permitir el desarrollo de la novela PSs, optimización de protocolos y nuevas indicaciones de PDT.

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir la apoptosis de las células. La Federal Drug Administration (FDA) ha aprobado el PDT para el tratamiento de queratosis actínica (AK), y las guías clínicas recomiendan PDT como tratamiento para algunos cánceres de piel no melanoma y el acné vulgaris1,2. Usos emergentes no dermatológicas para PDT incluyen el tratamiento de cánceres ginecológicos, próstata y gastrointestinal3. PDT es una modalidad terapéutica ventajosa ya que es bajo costo, no invasiva y asociada con mínimos efectos adversos y cicatrices2.
En el primer paso de la TFD, PS se aplica y permite la acumulación intracelular2. En los Estados Unidos, el ácido 5-aminolevulínico tópico (5-ALA) se utiliza comúnmente para tratar las AKs. Durante la incubación fase, 5-ALA se convierte en protoporfirina IX (PP-IX) a través de la ruta de biosíntesis de hemo en células incorporado3. Las células de cáncer y pre-han disminuido la actividad del ferrochelatase, que convierte la protoporfirina IX (PP-IX), en el producto final, heme. Como resultado, las células de cáncer acumulan PP-IX en comparación con las células normales4,5. Esta acumulación de PP-IX en el cáncer y las células precancerosas en comparación con el tejido circundante permite PDT a ser un enfoque orientado con mínimos efectos adversos. Irradiación de la luz conduce a oxígeno reactivo (ROS) las especies generación cuando el oxígeno acepta electrones excitados del PP-IX. PP-IX tiene un máximo de absorción en el espectro ultravioleta con pequeños picos en el espectro de luz visible, incluyendo azul y rojo luz2. Formación de ROS en última instancia puede conducir a la apoptosis celular, disrupción de la membrana, daño mitocondrial, modulación inmune, proliferación del keratinocyte y colágeno volumen6,7,8,9 , 10.
PDT se desarrolló en la década de 1970 y es una evolución de la modalidad terapéutica3. El protocolo aprobado por la FDA para el tratamiento de AKs recomienda incubación 5-ALA piel de 14 – 18 h, pero incubaciones de 1 a 2 h se utilizan en la práctica clínica2. In vitro, hemos demostrado que incubaciones de 5-ALA de 15 minutos más cortas pueden incrementar la apoptosis de las células del fibroblasto en comparación con los fibroblastos11,12. Además, se están estudiando chlorin novela, ftalocianina y PSs basados en nanopartículas para mejorar la eficacia de PDT3. Adjunto, presentamos un método en vitro para estudio PDT en un carcinoma de célula squamous adherente de las células. En este protocolo, se incuban las células SCC-13 con 0, 0.5, 1.0 y 2 mM 5-ALA de 30 min y fotoactivado con luz 417 nm azul 1.000 s. Medida de resultado primaria es apoptosis y necrosis, medido por citometría de flujo de annexin-V y aminoactinomycin 7 D (7-AAD). Este protocolo de tratamiento está diseñado para simular el PDT y puede ajustarse a estudiar el uso de la TFD con otras líneas celulares, photosensitizers, temperaturas de incubación o longitudes de onda de fotoactivación. Preparación de grupos de control adicional puede ser necesario, incluyendo el fluoróforo sin mancha, solo manchado, controles positivos y negativos para citometría de flujo. Una revisión exhaustiva de la teoría, protocolos, diseño experimental y compuerta para citometría de flujo necrosis apoptosis se puede encontrar en otra parte13.

<table><tbody><tr><td>Medio libre de suero de queratinocitos&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Medio de cultivo para células SSC-13</td></tr><tr><td>DMEM glutamax bajo en glucosa</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Posible medio de cultivo para otros tipos de células</td></tr><tr>Placas<td>de cultivo de 6 pocillos</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Solución azul, 0.4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Para conteo de células y recubrimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Luz BLU-U&nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Solicitud del fabricante</td><td>Se pueden utilizar otras luces LED azules, fluorescentes o halógenas&nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Solicitud del fabricante</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>FCCH100108&nbsp;</td><td>El yoduro de propidio puede reemplazar al 7-AAD. Viene con anexiona-V, 7-AAD y tampón de flujo</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Solicitud del fabricante</td><td>Se puede utilizar cualquier citómetro de flujo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara de recuento</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>Para el recuento de células y el recubrimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Solicitud del fabricante</td><td>Software de análisis de citometría de flujo</td></tr></tbody></table>

un enfoque in vitro de la terapia fotodinámica

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir la apoptosis de las células. La Federal Drug Administration ha aprobado el PDT para el tratamiento de la queratosis actínica, y guías de práctica clínicas recomiendan PDT como tratamiento para algunos cánceres de piel no melanoma y Acné vulgaris. PDT es una modalidad terapéutica ventajosa ya que es bajo costo, no invasiva y asociado con efectos adversos mínimos y asustando. En el primer paso de la TFD, PS se aplica y permite la acumulación intracelular. Posterior irradiación de la luz induce la formación de especies reactivas del oxígeno, que en última instancia puede conducir a la apoptosis celular, disrupción de la membrana, daño mitocondrial, modulación inmune, la proliferación del keratinocyte y facturación de colágeno. Adjunto, presentamos un método en vitro para estudio PDT en una línea de células adherentes. Este protocolo de tratamiento está diseñado para simular el PDT y puede ajustarse a estudiar el uso de la TFD con distintas líneas celulares, photosensitizers, temperaturas de incubación o longitudes de onda de fotoactivación. Carcinoma de células escamosas las células se incubaron con 0, 0.5, 1.0 y 2 mM de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) durante 30 min y fotoactivado con luz 417 nm azul 1.000 s. Medida de resultado primaria fue apoptosis y necrosis, medido por citometría de flujo D anexina V y 7 aminoactinomycin. Hubo un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis de la célula después de 30 minutos incubación de 5-ALA. Para lograr alta validez de la prueba, es importante mantener la incubación constante y luz de parámetros al realizar experimentos en vitro PDT. PDT es que una investigación clínica útil del procedimiento y en vitro puede permitir el desarrollo de la novela PSs, optimización de protocolos y nuevas indicaciones de PDT.

Después de SCC-13 las células fueron incubadas durante 30 minutos con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA e irradiadas con 1.000 s de luz, hubo un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis celular azul. Total apoptosis (media ± error de estándar de la media) era de 3.94 ± 0,34, 7.90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 y 38.33 ± 1.81 después de 30 min de incubación con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, respectivamente y 1000 segundos de azul la luz (figura 1). Comparamos el porcentaje medio de células apoptóticas entre 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA incubado grupos mediante ANOVA. Las células tratadas con 1 y 2 mM 5-ALA tenían un aumento significativo en la apoptosis de la célula en comparación con las células tratadas de 0 mM 5-ALA. Figura 2A muestra representativa flujo cytometric gating de forward scatter (FSC) versus dispersión lateral (SSC) SCC-13 células incubadas con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA. La compuerta del círculo encierra la población de células SCC-13. Para este experimento, se recogieron 7500 eventos y la puerta de población de células SCC-13 capturados por lo menos el 90% de los eventos. Figura 2B muestra un diagrama representativo de la 7-AAD en el eje x y la anexina V en el eje y. Las poblaciones celulares son bloqueadas en cuatro cuadrantes (Q1 a Q4) discriminar células apoptóticas. Células de Q1 (alta anexina v, bajo 7-AAD) representa que experimenta apoptosis temprana. Representan células de Q2 (alta anexina v, alta 7-AAD) sometidos a finales apoptosis o necrosis. Representa células de Q3 (baja anexina v, alta 7-AAD) que experimentan necrosis. Representa de Q4 (baja anexina v, bajo 7-AAD) las células que no experimenta apoptosis o necrosis. Para calcular el porcentaje de células que experimentan apoptosis, hemos añadido el porcentaje de células en Q1 y Q2. Discrepancia en longitud de período de incubación de 5-ALA, temperatura de incubación o fotoactivación dosis puede alterar la eficacia del PDT. Figura 3 muestra una representativa parcela citometría flujo anexina V y 7-AAD cuando se varía la temperatura de incubación (es decir, 27, 36 y 42 ° C). Hubo un aumento dependiente de la temperatura en la apoptosis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figura 1: incremento dosis dependiente en la apoptosis después de 30 minutos de incubación de 5-ALA. 5-ALA se incubaron a 36 ° C durante 30 minutos seguidos de 1.000 s de luz azul en las células SCC-13. Las barras representan el promedio porcentuales annexin-V las células positivas en cada tratamiento y grupo control. Experimentos se realizaron por triplicado técnica. Significación estadística se determinó mediante ANOVA, p &lt; 0.05 indicada con un asterisco (*). Barras de error representan el error estándar de media ± de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figura 2: Representante flujo Cytometry parcelas. (A) representante de dispersión hacia adelante vs lado dispersión citometría parcelas en unidades arbitrarias (UA) para ejes x e y - 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, las células incubadas. Para este experimento, se recogieron 7500 eventos y la puerta de población de células SCC-13 había capturado el 90% de los eventos. (B) representante de annexin-V vs 7-AAD flujo cytometry parcelas en AU para ejes x e y - 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, las células incubadas. Q1: temprana las células apoptotic, Q2: finales células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas y Q4: células viables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figura 3: 5-ALA en diferentes temperaturas de incubación puede alterar la eficacia de la PDT. Representante de annexin-V vs citometría de flujo 7-AAD parcelas en AU para ejes x e y - SCC-13 células incubadas con 0,5 mM 5-ALA en 27, 36 y 42 ° C. Q1: temprana las células apoptotic, Q2: finales células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas y Q4: células viables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir apoptosis. Presentamos un protocolo en vitro PDT diseñado para simular el PDT que puede utilizarse para estudiar las diferencias en incubación de PS y parámetros de tratamiento de la luz.

Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la terapia fotodinámica, también conocida como TFD. Las preguntas que se pueden responder mediante el uso de este método incluyen la duración de la incubación de un fotosensibilizador, o el uso de diferentes parámetros en el experimento, como el cambio de temperatura mediante el calentamiento o enfriamiento de las células. Esta técnica puede ayudar a facilitar el desarrollo in vitro de nuevos fotosensibilizadores, protocolos e indicaciones para la TFD.Comience colocando dos veces 10 a la cuarta celda en dos mililitros de medio de cultivo en cada pocillo de una placa de seis pocillos utilizando la técnica estéril para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, lavar las células con al menos dos mililitros de PBS y tratar los cultivos con diluciones de cero, cero coma cinco, uno o dos milímetros de 5-ALA recién preparado. Luego coloque la placa en un bloque calefactor de 36-37 grados centígrados durante 30 minutos protegido de la luz.Durante el procedimiento, recomendamos que durante la fase de incubación los investigadores utilicen un bloque calefactor para lograr una temperatura constante durante todo el período de incubación. Además, recomendamos cubrir las células durante el período de incubación con papel de aluminio para evitar la activación temprana del fotosensibilizador. Al final de la incubación, lavar las células de cada pocillo con dos mililitros de PBS.Y refresque los cultivos con dos mililitros de medio de cultivo fresco para la irradiación de luz azul. Antes de irradiar las células, caliente el dispositivo de luz azul a una longitud de onda de salida de 417 nanómetros durante un ciclo de 1.000 segundos y utilice un fotómetro para medir la irradiancia en la superficie de la célula, ajustando la distancia de la luz para lograr la irradiancia adecuada de acuerdo con la intensidad de la fuente de luz. A continuación, coloque las células tratadas con 5-ALA sobre una superficie negra bajo la luz azul durante 1.000 segundos para obtener una fluencia total de 10 julios por centímetro cuadrado.Durante la fotoactivación, recomendamos colocar las células sobre una superficie negra para evitar el reflejo de la luz y la dosificación inconsistente. Al final del tratamiento de fototerapia, lavar las células de cada pocillo con dos mililitros de PBS y separar las células con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% por pocillo. Después de tres a cinco minutos, confirme el desprendimiento y desactive la tripsina con 10%FBS y PBS.Transfiera las células de cada pocillo a tubos de flujo individuales de cinco mililitros y recoja las células por centrifugación. Añada 200 microlitros de tampón de flujo con anticuerpo de anexina-V conjugado a cada muestra. Vuelva a suspender las células y coloque los tubos en la incubadora durante 20 minutos para permitir la unión de la anexina-V.Al final de la incubación, agregue tres microlitros de 7-AAD a cada muestra y vuelva a incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, seguido de un análisis de la muestra realizado de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de citometría de flujo. Después de cinco tratamientos de ALA y fototerapia con luz azul, se observa un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis celular. Para calcular el porcentaje de células que experimentan apoptosis, se suma el porcentaje de células en los cuadrantes de anexina V alta, 7-AAD baja y anexina V alta, 7-AAD alta.Las inconsistencias en la duración del período de incubación de cinco ALA, la temperatura de incubación o la dosis de irradiación de fotoactivación pueden alterar la eficacia de la fototerapia, lo que resulta en un aumento de la apoptosis dependiente de la temperatura, por ejemplo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la RTQPCR y el Western blot, para determinar cómo la PDT altera la expresión génica y la actividad de las proteínas. Este método permite a los investigadores interesados en la terapia fotodinámica descubrir in vitro los efectos sobre las células cancerosas de la piel y otras enfermedades de la piel.

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Investigación

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La terapia fotodinámica (TFD) es un método no invasivo y no quirúrgico para el tratamiento del cáncer de pulmón. Los fotosensibilizadores se acumulan selectivamente en el tejido tumoral y provocan la muerte de las células tumorales en presencia de oxígeno y la longitud de onda adecuada de la luz. En este video de protocolo, se utiliza el método basado en PDT para evaluar el potencial fototóxico de un potencial fotosensibilizador en células de cáncer de pulmón.

Ensayo de fototoxicidad in vitro: un método basado en PDT para evaluar el potencial fototóxico de un fotosensibilizador en células de cáncer de pulmón

Este video muestra una técnica para eliminar selectivamente células específicas de un cultivo celular 3D mixto a través de fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano. En este método, las células objetivo se identifican con precisión utilizando un anticuerpo conjugado con un fotoabsorbente NIR. La irradiación posterior con luz infrarroja induce la muerte celular, eliminando eficazmente las células objetivo del cultivo 3D.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para la eliminación de células dirigidas en cultivos 3D mixtos

El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.

Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Este protocolo describe un método para la fabricación de nanopartículas poliméricas conductoras mezcladas con fullereno. Estas nanopartículas fueron investigadas por su uso potencial como fotosensibilizadores de próxima generación para la Terapia Fotodinámica (PDT).

Terapia fotodinámica con Blended polímero conductor / Fullerene nanopartículas fotosensibilizadores

Eliminar células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en tejido establecido, sin embargo, existe una necesidad urgente de un método de eliminación celular en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, presentamos un método para la eliminación de células específicas a partir de un cultivo celular mixto en 3D utilizando fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

Aquí, describimos un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar con éxito ensayos de terapia fotodinámica in vitro (TFD) utilizando cultivo de células HeLa bidimensionales y verteporfina como fotosensibilizador.

Un dispositivo de terapia fotodinámica construido internamente y basado en diodos emisores de luz para mejorar la citotoxicidad de la verteporina en un modelo de cultivo celular 2D

Este protocolo presenta un conjunto de experimentos adoptados para la evaluación de péptidos anticancerígenos fotoconmutables, que pueden ser utilizados en el cribado preclínico de dichos compuestos. Esto incluye la evaluación de citotoxicidad en cultivos celulares 2D y 3D, la evaluación de la eficiencia de fotoisomerización ex vivo (tejido modelo) y la eficacia in vivo .

Evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer

Este protocolo describe un método sencillo y económico para evaluar la eficacia de los fotosensibilizadores potenciales en la inactivación fotodinámica antibacteriana (aPDI), utilizando un formato de placa de 96 pocillos combinado con una fuente de luz de panel LED. Este enfoque permite la prueba simultánea de múltiples condiciones experimentales, incluidas diferentes concentraciones, compuestos y cepas bacterianas.

Cribado in vitro basado en LED para la evaluación de moléculas fotoactivables en la inactivación fotodinámica bacteriana

Este manuscrito presenta un novedoso e innovador dispositivo de iluminación impreso en 3D para estudiar la terapia fotodinámica mediada por la rosa de Bengala in vitro.

Desarrollo de un innovador dispositivo de iluminación basado en LED para la aplicación in vitro de terapia fotodinámica con rosa de Bengala

Aprende un protocolo in vitro de terapia fotodinámica para estudiar la apoptosis celular mediante fotosensibilizadores e irradiación con luz azul. Este método permite optimizar parámetros terapéuticos y evaluar su eficacia en cáncer de piel.

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