Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la terapia fotodinámica, también conocida como TFD. Las preguntas que se pueden responder mediante el uso de este método incluyen la duración de la incubación de un fotosensibilizador, o el uso de diferentes parámetros en el experimento, como el cambio de temperatura mediante el calentamiento o enfriamiento de las células. Esta técnica puede ayudar a facilitar el desarrollo in vitro de nuevos fotosensibilizadores, protocolos e indicaciones para la TFD.

Comience colocando dos veces 10 a la cuarta celda en dos mililitros de medio de cultivo en cada pocillo de una placa de seis pocillos utilizando la técnica estéril para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, lavar las células con al menos dos mililitros de PBS y tratar los cultivos con diluciones de cero, cero coma cinco, uno o dos milímetros de 5-ALA recién preparado. Luego coloque la placa en un bloque calefactor de 36-37 grados centígrados durante 30 minutos protegido de la luz.

Durante el procedimiento, recomendamos que durante la fase de incubación los investigadores utilicen un bloque calefactor para lograr una temperatura constante durante todo el período de incubación. Además, recomendamos cubrir las células durante el período de incubación con papel de aluminio para evitar la activación temprana del fotosensibilizador. Al final de la incubación, lavar las células de cada pocillo con dos mililitros de PBS.

Y refresque los cultivos con dos mililitros de medio de cultivo fresco para la irradiación de luz azul. Antes de irradiar las células, caliente el dispositivo de luz azul a una longitud de onda de salida de 417 nanómetros durante un ciclo de 1.000 segundos y utilice un fotómetro para medir la irradiancia en la superficie de la célula, ajustando la distancia de la luz para lograr la irradiancia adecuada de acuerdo con la intensidad de la fuente de luz. A continuación, coloque las células tratadas con 5-ALA sobre una superficie negra bajo la luz azul durante 1.000 segundos para obtener una fluencia total de 10 julios por centímetro cuadrado.

Durante la fotoactivación, recomendamos colocar las células sobre una superficie negra para evitar el reflejo de la luz y la dosificación inconsistente. Al final del tratamiento de fototerapia, lavar las células de cada pocillo con dos mililitros de PBS y separar las células con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% por pocillo. Después de tres a cinco minutos, confirme el desprendimiento y desactive la tripsina con 10%FBS y PBS.

Transfiera las células de cada pocillo a tubos de flujo individuales de cinco mililitros y recoja las células por centrifugación. Añada 200 microlitros de tampón de flujo con anticuerpo de anexina-V conjugado a cada muestra. Vuelva a suspender las células y coloque los tubos en la incubadora durante 20 minutos para permitir la unión de la anexina-V.

Al final de la incubación, agregue tres microlitros de 7-AAD a cada muestra y vuelva a incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, seguido de un análisis de la muestra realizado de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de citometría de flujo. Después de cinco tratamientos de ALA y fototerapia con luz azul, se observa un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis celular. Para calcular el porcentaje de células que experimentan apoptosis, se suma el porcentaje de células en los cuadrantes de anexina V alta, 7-AAD baja y anexina V alta, 7-AAD alta.

Las inconsistencias en la duración del período de incubación de cinco ALA, la temperatura de incubación o la dosis de irradiación de fotoactivación pueden alterar la eficacia de la fototerapia, lo que resulta en un aumento de la apoptosis dependiente de la temperatura, por ejemplo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la RTQPCR y el Western blot, para determinar cómo la PDT altera la expresión génica y la actividad de las proteínas. Este método permite a los investigadores interesados en la terapia fotodinámica descubrir in vitro los efectos sobre las células cancerosas de la piel y otras enfermedades de la piel.