Name: En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a realizar imagen de dos fotones en corteza cerebral de ratones neonatos para estudiar dinámica neuronal y cambios morfológicos en tiempo real. Este protocolo permite analizar desarrollo cortical y modelos de enfermedad.

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Los autores agradecen su asistencia técnica T. Sato, M. Kanbayashi y S. Kouyama. Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI Grant números JP15K14322 y JP16H06143, la Fundación de ciencia de Takeda, la Fundación conmemorativa de Uehara y el proyecto de investigación colaborativa de Niigata University cerebro investigación Instituto 2017-2923 (H.M.) y por KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 y JP15H04263 y Grant en la investigación científica en áreas de innovación "Regulación dinámica de la función cerebral por chatarra y sistema de construcción" (JP16H06459) de MEXT (T.I.).

Los experimentos deben realizarse con arreglo a las directrices de bienestar de los animales prescritas por la institución del experimentador.
1. preparación de cachorros para la proyección de imagen
Nota: Cachorros con las neuronas corticales escasamente marcadas pueden obtenerse en el útero la electroporación (IUE) de Supernova vectores5,6. El sistema de Supernova consiste en los siguientes dos vectores: TRE-Cre y CAG-loxP-parada-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. En este sistema, escasa de etiquetado se basa en fuga TRE. En una población escasa de neuronas transfected, TRE conduce la expresión débil de Cre y tTA. Posteriormente, sólo en estas células, la expresión del gen X, facilita una regeneración positiva de los ciclos de tTA-TRE. El logrado etiquetado rala y brillante permite la visualización de los detalles morfológicos de las neuronas individuales en vivo. Detalles de la IUE no están descritos en este protocolo ya que han sido descritos en otra parte7,8,9,10,11.
<ol><li>Preparan ratones embarazadas programado para IUE.</li>
	<li>Preparar una solución de ADN para la IUE. Escasa etiquetado con RFP, utilice una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl) o una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl). Nota: Varias proteínas se pueden expresar en las neuronas marcadas usando diferentes combinaciones de vectores. También, varios genes pueden ser derribado o golpeado-hacia fuera específicamente en las células etiquetadas5,6 (p. ej., una serie de vectores para el sistema de Supernova están disponibles del centro de investigación RIKEN BioResource y de Addgene).</li>
	<li>Realizar regular IUE7,8,9,10,11 para etiquetar las neuronas corticales. Para el etiquetado de las neuronas de la capa 4, use embrionarios embriones día 14.</li>
	<li>Espera para la entrega del cachorro y crecimiento.</li>
</ol>2. cirugía
<ol><li>Anestesiar el postnatal día 5 (P5) cachorro utilizando gas isoflurano (1.0%). Realice una prueba de cola-pellizco para comprobar el nivel de anestesia. Si el cachorro responde a la presión, aumentar la concentración de isoflurano (hasta 2,0%) o esperar hasta que desaparezca la respuesta. Mantener la temperatura corporal del cachorro durante la cirugía usando una almohadilla térmica.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea un analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).</li>
	<li>Esterilizar la piel del cachorro que cubre el cráneo limpiándolo con etanol al 70% tres veces.</li>
	<li>Quitar aproximadamente2 de 20 mm de la piel que cubre el cráneo con unas tijeras esterilizadas con etanol al 70% (figura 1A).</li>
	<li>Retire la fascia del cráneo usando pinzas esterilizadas y un hisopo de algodón limpio y estéril (figura 1A).</li>
	<li>Aplique el adhesivo de tejido utilizando puntas de carga a la superficie de la piel incisas a detener el sangrado. No aplique adhesivo tisular para el área de proyección de imagen (figura 1B) porque esto dificulta la apertura del cráneo.</li>
	<li>Colocar el cachorro sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) y deje que se recupera de la anestesia. Espere hasta que el adhesivo tisular ha secado y solidificado (aproximadamente 30 min).</li>
	<li>Si es necesario, aplique más Adhesivo tisular y espere que se seque y solidifique.</li>
</ol>3. preparación de la ventana craneal
<ol><li>Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.0-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.</li>
	<li>Abra cuidadosamente el cráneo con una cuchilla de afeitar esterilizada dejando la duramadre intacta (1 mm de diámetro) (figura 1). Use una esponja de gelatina (cortada en trocitos, aproximadamente < 2 mm3, con unas tijeras esterilizadas y aplicarlas con pinzas) en corteza buffer12 (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L glucosa, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 y 2 mmol/L de MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura) para detener el sangrado. Al abrir el cráneo, se aplica un buffer de corteza para mantener húmeda la superficie del cerebro.</li>
	<li>Quite cualquier buffer y la sangre de la superficie dural con una esponja de gelatina. Se aplica a puntas de capa delgada del 1.0% uso de agarosa de bajo punto de fusión (disuelto en tampón de corteza) amarillo. Usando una máquina del bloque de calor, mantener la temperatura de la solución de agarosa a 42° C hasta la aplicación. Nota: El agotamiento del búfer y la sangre debe realizarse desde el lado de la craneotomía y teniendo cuidado de que la esponja de gelatina seca no entren en contacto con la duramadre. No hacerlo puede dañar la duramadre.</li>
	<li>Se aplica un cubreobjetos de vidrio redondo (no. 1, 3 mm de diámetro) en la capa de gel de agarosa. Eliminar todas las burbujas entre el cubreobjetos y la capa de gel de agarosa vertiendo un exceso de gel de agarosa entre ellos. Retirar el gel sobrante que sobresale por debajo del cubreobjetos con unas pinzas (figura 1 y 1E).</li>
	<li>Asegure el cubreobjetos con cemento dental (Figura 1F).</li>
	<li>Mezclar el cemento en polvo y el líquido del cemento. Aplique la mezcla con puntas amarillas antes de llega a ser solidificado. No Aplique cemento dental hacia la dura, ya que esto puede dañar el cerebro.</li>
	<li>Coloque un estéril titanio barra (por encargo, aproximadamente 30 mg, ver figura 1) en el hueso craneal con cemento dental. Alinee la barra de titanio y el cubreobjetos (en la superficie de la duramadre) en paralelo a capturar fácilmente imágenes.</li>
	<li>Cubre el cráneo expuesto con cemento dental (figura 1 H).</li>
	<li>El cachorro se recupera de la anestesia. Mantenerlo en un calentador (37 ° C) hasta que el cemento dental ha solidificado (1 h).</li>
</ol>4. dos fotones de imagen
Nota: Las imágenes en vivo en la figura 2 se adquirieron utilizando un microscopio de dos fotones con un laser de titanio zafiro (viga de diámetro [1/e2]2: 1,2 mm).
<ol><li>Establecer la longitud de onda de láser de dos fotones. Para la excitación de la RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 μm de profundidad). Nota: Se debe reducir la potencia del láser como la posición de z se mueve hacia arriba.</li>
	<li>Limpie la superficie del cubreobjetos con etanol al 70%.</li>
	<li>Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5% - 2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.</li>
	<li>Fije el cachorro a la placa de titanio en la etapa de proyección de imagen usando una barra de titanio en la cabeza del cachorro (figura 2A y 2B). Ajustar la cabeza de tal manera que el cubreobjetos esté paralelo a la lente del objetivo con la etapa del goniómetro (figura 2B). Mantener la temperatura corporal del cachorro mediante una almohadilla caliente (37 ° C).</li>
	<li>Establece la concentración de isoflurano en 0,7% - 1.0%. Nota: Una concentración de isoflurano muy alta puede causar la muerte accidental de la cría durante la proyección de imagen.</li>
	<li>Coloque la etapa de proyección de imagen bajo la lente del objetivo (20 X, NA 1.0) del microscopio de dos fotones (figura 2B y 2C).</li>
	<li>Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos. Uso de epi-fluorescencia para localizar las neuronas marcado con la proteína fluorescentes en la zona donde la duramadre se ha expuesto.</li>
	<li>Adquirir imágenes z-stack μm 1.4 intervalos. Para capa 4 neurona de la proyección de imagen, fijar el ancho de z a 150-300 μm a la imagen la completa morfología dendrítica (Figura 2D y 2E). Uso lento de exploración y un promedio para obtener imágenes claras que muestran la morfología neuronal (tarda generalmente > 20 minutos para adquirir la completa morfología dendrítica). Nota: Se recomiendan los siguientes parámetros para la proyección de imagen. Longitud de onda de excitación: 1.000 nm, escáner: tipo galvanómetro, espejo dicroico: 690 nm, filtro de emisión: 575-620 nm bandpass, detector: tipo de GaAsP, ganancia ajuste > 100, imagen tamaño > 512 x 512 μm, campo de visión > 600 x 600 μm, pixel Resolución < 1.2 μm.</li>
</ol>5. recuperación y enfermería
<ol><li>Separar el cachorro de la etapa de proyección de imagen.</li>
	<li>Colocar el cachorro sobre un calentador (37 ° C) y permita que recuperar (15 min).</li>
	<li>El cachorro la alimentación leche caliente con una micropipeta en intervalos de 2 horas y estimular suavemente el estómago para permitir la excreción. Confirmar que el cachorro es beber leche por la medición de su peso corporal.</li>
</ol>6. volver a la proyección de imagen
<ol><li>Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch. Conéctelo a la etapa de proyección de imagen.</li>
	<li>Localizar las neuronas anteriormente reflejadas y adquirir una imagen z-stack. La identificación de las neuronas es fácil debido a su escasa etiquetado con Supernova.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1 6.2 hasta que finalice la proyección de imagen. Nota: El cachorro puede ser reflejado hasta 18 h sin perder peso. 
</li>
</ol>

<ol><li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li>
<li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272(2005).</li>
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<li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring%3A+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li>
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<li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li>
<li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li>
<li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLIFE%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839(2017).</li>
<li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos en el protocolo y resolución de problemas:
El paso más crítico del protocolo es la extirpación del cráneo (paso 3.2 del Protocolo). Sobre inserción, la hoja de afeitar a menudo se adhiere a la duramadre, provocando hemorragia dural y daño en el cerebro. Esto puede evitarse añadiendo una gota de tampón de corteza en el cráneo y el cráneo en tampón de corteza.
Sangrado de la duramadre y la piel después de preparación de ventana craneal conduce a la oclusió...

El cableado exacto de los circuitos neuronales en la corteza cerebral es esencial para funciones más altas del cerebro como percepción, cognición y aprendizaje y la memoria. Circuitos corticales se refinan dinámicamente durante el desarrollo postnatal. Estudios han investigado el proceso de usar el circuito cortical formación histológica y en vitro el análisis de la cultura. Sin embargo, la dinámica de formación de circuito en los mamíferos de vida ha permanecido en su mayoría inexplorada.
Microscopía de dos fotones ha sido ampliamente utilizado para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro de ratón adulto1,2. Sin embargo, debido a problemas técnicos, sólo un número limitado de estudios ha abordado la formación de circuitos neuronales en ratones recién nacidos. Por ejemplo, Carrillo et al realizar la proyección de imagen de Time-lapse de escalada las fibras en el cerebelo en la segunda semana postnatal3. Portera-Cailliau et al informó la proyección de imagen de los axones corticales capa 1 en la primera semana postnatal4. En el presente estudio, se resume un protocolo para la observación de la capa 4 cortical neuronas y sus dendritas en ratones recién nacidos. Resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo, que incluye dos metodologías, se expresan en nuestra reciente publicación5. En primer lugar, utilizamos la Supernova vector sistema5,6 para el etiquetado de neuronas individuales del cerebro neonatal. En el sistema de la Supernova, las proteínas fluorescentes utilizadas para etiquetar neuronal son caída intercambiable y etiquetada gene célula-específico y análisis de la edición de octavos de final también son posibles. En segundo lugar, se describe un procedimiento quirúrgico para la preparación de ventana craneal en ratones neonatales frágil. Juntos, estas metodologías permiten la observación en vivo de neuronas individuales en el cerebro neonatal.

<table><tbody><tr><td>pK031. Autores de TRE-Cre-Disponible</td><td></td><td></td> <td>en RIKEN BRC y Addgene</td></tr><tr><td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td><td>Autores-Disponible</td><td></td> <td>en RIKEN BRC y Addgene</td></tr><tr><td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td><td></td> <td>Autores-Disponible</td> <td>de los autores</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Wako</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>410 Unidad de Anestesia (máquina de gas isoflurano)</td><td>Univentor</td><td>8323101</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (adhesivo tisular)</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td></td></tr><tr><td>M&micro; ltiFlex Round (punta de carga)</td><td>Sorenson</td><td>13810</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (esponja de gelatina)</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>Bajo punto de fusión</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de forma redonda</td><td>Matsunami-Hecho</td><td></td> <td>a medida</td></tr><tr><td>Unifast 2 (cemento dental)</td><td>GC-Barra</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>titanio</td><td>Autores-Personalizado</td><td></td><td> hecho (ver Figura 1G)</td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofeno)</td>Zoetis-Microscopio <td></td><td></td><td>inyectable</td></tr><tr><td>de 2 fotones</td><td>Zeiss</td><td>LSM7MP</td><td></td></tr><tr><td>Láser de titanio-zafiro</td><td>Spertra-Physics</td><td>Mai-Tai eHPDS Placa de</td><td></td></tr><tr><td>titanio</td><td>Autores-Hecho</td><td></td> <td>a medida (ver Figura 2A)</td></tr><tr><td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td><td>BITPLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etapa de goniómetro</td><td>Thorlabs</td><td>GN2/M</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Proyección de imagen de dos fotones es una poderosa herramienta para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro mamífero. Sin embargo, un número limitado de en vivo de imágenes métodos existe para examinar el tejido cerebral de los mamíferos recién nacidos vivos. Aquí se resume un protocolo de neuronas corticales individuales en vida ratones neonatales de la proyección de imagen. Este protocolo incluye las siguientes dos metodologías: (1) el sistema de Supernova para rala y brillante etiqueta de neuronas corticales en el cerebro en desarrollo y (2) un procedimiento quirúrgico para el frágil cráneo neonatal. Este protocolo permite la observación de cambios temporales de neurites corticales individuales durante las etapas neonatales con un alto cociente signal-to-noise. Silenciamiento del gen de célula-específica marcada y octavos de final también se logra combinando la Supernova con RNA de interferencia y gene CRISPR/Cas9 sistemas de edición. Este protocolo puede, por lo tanto, utilizarse para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos de la imagen de Time-lapse de dos fotones de neuronas corticales de la capa 4 mediante el presente Protocolo. Con el fin de análisis, seleccione las neuronas dendríticas clara morfología a lo largo de los periodos de proyección de imagen. Hemos analizado la morfología dendrítica de neuronas reflejadas utilizando el software de análisis morfológico. Reconstrucción de la morfología dendrítica representativa...

Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, especialmente aquellos relacionados con la formación de zócalos de neurona. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden analizar los cambios morfológicos de las neuronas individuales en ratones neonatales vivos. Comience con un cachorro anestesizado después del parto cinco y proceda sólo en ausencia de una reacción a la prueba de pellizcar la cola.Primero, esteriliza el cuero cabelludo limpiándolo con 70%etanol. Luego, usa tijeras esterilizadas con 70%etanol para eliminar aproximadamente 20 milímetros cuadrados de la piel que cubre el cráneo. A continuación, utilice fórceps estériles y un hisopo de algodón limpio empapado en tampón de corteza, para eliminar la fascia del cráneo.Utilice una punta de carga para aplicar adhesivo tisular en la superficie de la piel incizada para detener el sangrado evitando la superficie a tomar imágenes. Coloque el cachorro en otra almohadilla de calentamiento, establecido en 37 grados Celsius, y deje que se recupere de la anestesia. Espere aproximadamente 30 minutos hasta que el adhesivo del tejido se haya secado y solidificado.Una vez que el adhesivo de tejido se haya secado, comience la preparación de la ventana craneal en el ratón anestesiado. Aplica una gota de tampón de corteza sobre el cráneo, luego usa una cuchilla de afeitar estéril para abrir cuidadosamente un área de un milímetro de diámetro del cráneo, dejando la dura intacta. Aplique el tampón de la corteza para mantener la superficie del cerebro húmeda.Use un pequeño trozo de esponja de gelatina empapada en tampón de corteza para detener cualquier sangrado. Utilice una pieza nueva para comprimir un lado de la craneotomía y drenar cualquier tampón y sangre de la superficie dural sin tocar la dura. Este es el paso más crítico para preparar una ventana clara.La dura debe estar intacta y el cepillo debe retirarse de la duración expuesta. A continuación, utilice una punta de pipeta para aplicar una capa delgada de un porcentaje de agarosa de fusión baja, disuelta en tampón de corteza. Aplica un resbalón redondo de vidrio de tres milímetros sobre la capa de gel de agarosa.Retire todas las burbujas entre el resbalón de la cubierta y la capa de gel de agarosa vertiendo en exceso de gel de agarosa entre ellas. Use pinzas para eliminar el exceso de gel, sobresaliendo de debajo del resbalón de la cubierta. Mezclar el polvo de cemento y el líquido de cemento.Utilice una punta de pipeta para aplicar la mezcla en el cráneo antes de que se solidifice. A continuación, adjunte una barra de titanio hecha a medida al hueso craneal utilizando cemento dental. Alinee la barra de titanio y la cubierta se deslice en paralelo para capturar imágenes fácilmente.Cubra el cráneo expuesto con cemento dental. Luego, inyecte por vía subcutánea un analgésico. Coloque al cachorro en una jaula de recuperación en una almohadilla de calor de 37 grados centígrados durante una hora hasta que el cemento dental se haya solidificado.Para comenzar la toma de imágenes, primero establezca la longitud de onda del láser de dos fotónicos. Para la excitación RFP, utilice una longitud de onda de 1000 nanómetros. Limpie la superficie del resbalón de la cubierta con 70%etanol.Fije el cachorro anestesiado a la placa de titanio en el escenario de imágenes, utilizando la barra de titanio. Utilice la etapa de goniómetro, para ajustar la cabeza, de modo que el resbalón de la cubierta es paralelo a la lente objetivo. Mantener la temperatura corporal del cachorro durante la toma de imágenes utilizando una almohadilla de calentamiento establecida en 37 grados Celsius y reducir la concentración de isoflurano a 0.7%a 1%Coloque la etapa de imagen bajo la lente objetivo 20x del microscopio de dos fotones.Aplique una gota de agua en el resbalón de la cubierta. Configure el software para adquirir imágenes de pila Z a intervalos de 1,4 micras. Para las imágenes de neuronas de capa cuatro, establezca el ancho Z en entre 150 y 300 micras para crear una imagen de toda la morfología dendrítica.Utilice el escaneo lento y el promedio para obtener imágenes claras que muestren la morfología neuronal. Por lo general, se tarda más de 20 minutos en adquirir toda la morfología dendrítica. Esta imagen muestra una imagen representativa de la pila Z de la capa cuatro neuronas corticales del cachorro P5.La flecha indica la neurona que se va a analizar. Las neuronas con dendritas borrosas deben eliminarse del análisis. Esta imagen muestra una imagen de aumento más alta de la neurona indicada en la imagen anterior.Las puntas de flecha azules indican puntas dendríticas que se retraerán en el siguiente punto de tiempo, y las pequeñas puntas de flecha blancas indican el axón de una celda vecina. Después de 4,5 horas, las puntas dendríticas con puntas de flecha azules se retraen, y las puntas dendríticas con puntas de flecha amarillas son alargadas. Aquí se muestra una reconstrucción de morfología dendrítica representativa, las neuronas que muestran dendritas desconectadas como se ve aquí, deben ser excluidas de los análisis.Al intentar este procedimiento, es importante mantener la dura intacta durante el proceso. Usando este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como en la toma de imágenes de propulsión para responder preguntas adicionales relacionadas con el patrón de actividad de la neurona en el cerebro neonatal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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