Name: DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende microinyección de dsRNA en mosquitos y moscas de la casa para evaluar expresión génica y fecundidad. Este método permite entregar dosis cuantificables y estudiar letalidad multigeneracional en insectos dípteros.

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Los autores agradecen Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li y Roxie White (USDA-ARS) para ayudan con la adquisición de datos y análisis. También agradecemos a los doctores Pia Olafson (USDA-ARS) y Ke Wu (Universidad de Florida) para una revisión crítica del manuscrito y Niklaus Hostettler (Universidad de Florida) para filmar las imágenes de microscopio. La financiación fue proporcionada por el USDA, el WII - 141C proyecto de la marina de guerra y centro de salud de pública de cuerpo de Marina y el programa de protección de combatientes de la guerra desplegada. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño o la dirección del estudio o el desarrollo del manuscrito.

1. insecto preparación
<ol><li>Anestesiar los mosquitos al les refrigeración a 4 ° C durante varias horas o de 2 minutos de exposición a CO2 y a 4 ° C antes de las inyecciones. Frío anestesiar a moscas en 4 ° C 2\u20123 h antes de las inyecciones. Velar que los mosquitos y las moscas están apoyadas si oviposición es una variable de respuesta. Nota: El método de anestesia del mosquito depende de la especie y cepa, por ejemplo, Culex recuperar mucho más rápido de anestesia fría que Aedes aegypti y por lo tanto es preferible CO2 caída.</li>
	<li>En el hielo, etapa mosquitos o moscas utilizando fórceps suave para apoyarlas ventralmente exponen cuidadosamente en microscopio diapositivas ~0.5 centímetros aparte. Diapositivas estándar pueden contener dos filas de 6 mosquitos o moscas de casa 6-7. Deje un espacio de 1 a 1,5 cm en el extremo derecho o izquierdo de la diapositiva de mosquitos o moscas para facilitar el manejo de diapositivas.</li>
	<li>Mantener diapositivas de insectos escenificadas a 4 ° C en cajas Petri grande hasta que esté listo para la inyección. Nota: Taladrar un agujero a través de la tapa de la caja de Petri evitará insectos de ser molestado por desplazamiento de aire cuando tapado. Colocar el portaobjetos en un par de tubos capilares de vidrio fijados a la parte inferior del plato facilitará la eliminación de la placa de Petri.</li>
</ol>2. insecto inyección
<ol><li>Preparar el dsRNA de Estep et al. 5 y Sanscrainte et al. 9. Si libre de contaminantes, dsRNA puede cuantificarse mediante el uso de un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 260 nm y calcular la concentración de RNA en μg/mL como un260 × dilución factor × 40.</li>
	<li>Configurar sobre una mesa chill o cubo de hielo superficial de disección microscopio y microinyector para realizar las inyecciones en los anestesiados por el frío de los mosquitos y moscas (ver paso 1.1 – 1.3 y figura 1).</li>
	<li>Tire de Capillares de vidrio de hasta una punta fina con extractor de aguja (configuración: calentador = 15 unidades, solenoide = 4 A). Nota: Ver Tabla de materias para obtener más información del fabricante.</li>
	<li>Coloque la aguja capilar en un microinyector según instrucciones del fabricante y punta de la aguja de rotura por pellizcos con un par de pinzas para producir un punto agudo. Nota: Tamaños de abertura de aguja sugerido son ~ 150 μm para el mosquito y 250 μm para la mosca doméstica.</li>
	<li>Set microinyectora para volumen de dispensación deseado. Movimiento de menisco de ~ 50 alícuotas de nL es fácilmente observable y recomendado para microinyecciones de mosquito. Si está disponible, habilitar la configuración de inyección rápida. Enjuague la aguja de llenado y expulsión de agua libre de nucleasa 3 veces.</li>
	<li>Preparan soluciones para inyección en una concentración tal que 100\u2012150 nL proporcionará la dosis deseada para los mosquitos y 500 nL se proporcionan deseado dosis para moscas de la casa. Nota: Se sugiere dosis iniciales: 1 μg por cada mosquito y 5 μg de cada mosca5,9.</li>
	<li>Opcionalmente para los mosquitos, agrega rodamina B (para facilitar la visualización) soluciones a una concentración final de 3.0 μg/mL. Nota: El tinte será claramente visible por su color rosa después de la inyección a través de la cutícula casi transparente en la superficie ventral en la intersección de abdomen/tórax.</li>
	<li>Pipetear 3 – 4 μL de solución para inyectar en una superficie limpia (como un pedazo de la película de parafina) y sacar en la aguja de vidrio sin aspirar en aire. Oprima el botón de inyectar repetidamente hasta que el líquido comienza a dispensar de la aguja y limpie suavemente las gotas con un limpiador de tarea delicada. Nota: Mientras que algunos modelos de micromanipuladores requieren rellenar la jeringa, el inyector que se hace referencia en la Tabla de materiales no.</li>
	<li>Usando un marcador de punta ultra fina, dibuja marcas de hash ~ 1 mm aparte a partir del menisco de líquido a la caña de la aguja. Esto ayuda visualizar el movimiento del menisco y asegurar que la solución ha entrado en el mosquito durante la inyección.</li>
	<li>Establecer la diapositiva de mosquitos o moscas (ya preparada en los pasos 1.2 – 1.3) debajo de la aguja en la mesa chill o hielo (figura 1). Asegúrese de que campo de visión en el microscopio es suficientemente ancha como para ver el menisco de la solución en la aguja.</li>
	<li>Para los mosquitos, alinear la aguja con el tercio medio de la mesokatepisternum (figura 2A) y mientras apoya el mosquito contra la aguja con el fórceps en el lado opuesto, pinchar suavemente la cutícula con la punta de la aguja utilizando el Micrómetro de microinyector.</li>
	<li>Moscas de casa, alinear la aguja con el mesopleuron (figura 2B) y mientras que apoya la marcha contra la aguja, pinchar suavemente la cutícula con la punta de la aguja.</li>
	<li>Suavemente Deslice la aguja en el mosquito o mosca cuerpo hasta que la punta ha pasado a través de la línea media. Nota: Insertar la aguja demasiado poco a menudo resulta en el rebordear líquido inyectado por el insecto (ver paso 2.15).</li>
	<li>Mirando para el movimiento del menisco líquido en la aguja, oprima el botón inject hasta que se ha inyectado la cantidad deseada de líquido. Para los mosquitos, si a 50,6 alícuotas de nL, oprima 2 X ~ 100 nL o 3 X de ~ 150 nL. Para moscas de la casa, oprima el botón de inyectar hasta ~ 500 nL se ha inyectado (es decir, con alícuotas de nL 69 pulse 7 X para 483 nL).</li>
	<li>Si el menisco no se mueve, lentamente Deslice el mosquito o volar la aguja mirando para el movimiento del menisco. Si una parte de los granos de la solución inyectada de la cutícula al retiro de la aguja o si el menisco no se mueve, deseche el insecto como esta inyección no tuvo éxito.</li>
	<li>Transferir con éxito inyectados mosquitos en grupos de 10-15 o casa vuela en grupos de 5 para borrar 3,5 oz con tazas. Cubierta con tul o malla y recuperar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de los mosquitos y las moscas se han recuperado (1 – 2 h), invertir cada taza de explotación sobre una bola de algodón empapada con solución de sacarosa al 10%. Nota: La inversión de la taza sobre el SIDA de algodón de sacarosa en la supervivencia de más fácil acceso a una comida de azúcar10.</li>
	<li>Enjuague la aguja como en el paso 2.5 entre soluciones de la inyección. Cuando termine de inyectar, descarte las agujas usadas en un contenedor apropiado.</li>
</ol>3. bioensayo de mortalidad y la oviposición de aedes aegypti
<ol><li>Tres días después de la inyección, continúan los mosquitos con 10% de sacarosa y anote el número de mosquitos visiblemente muertos.</li>
	<li>Llene una membrana artificial de 12 pulgadas (como tripa de salchicha de colágeno) con sangre fresca (es decir, bovino para Aedes aegypti) y el calor a 60 ° C en baño de agua caliente.</li>
	<li>Brevemente secar la membrana haciendo rodar sobre una toalla de papel y poner en las tapas de tul de 3.5 oz claro con tazas. Para mejorar la alimentación, spike sangre con 1 mM ATP después de haber calentado como un phagostimulant o por el asa la morcilla caliente con manos limpias dejar humanos volátiles en la superficie de la cubierta.</li>
	<li>Después de sangre alimentación, vuelva a colocar la bola de algodón empapada con sacarosa al 10% sobre las copas de celebración y mosquitos descansar ~ 24 h antes de transferir a tazas de oviposición.</li>
	<li>Tazas de oviposición de construcción llenando claro 3,5 oz tazas de bioensayo con ~ 30 mL desionizada H2O y colocando un trozo de papel de germinación de la semilla (~ 4 cm de ancho y 5 cm de largo con crestas corre verticalmente) en la parte inferior de la Copa y contra el costado (Figura 3A) . Cubierta con tul o malla y corte una abertura pequeña (~ 1 cm) en la tapa de tul o malla.</li>
	<li>En la alimentación de sangre después de 24 h, corte una hendidura pequeña (~ 1 cm) en la tapa de tul de la taza de explotación y sólo las hembras individuales que alimentado con éxito la transferencia, con un bolo de sangre visible en el abdomen, por la aspiración suave de boca en las tazas de oviposición (1 taza de mujer/oviposición). Sellar el corte pequeño en la tapa de la oviposición con una bolita de algodón saturada de sacarosa 10%.</li>
	<li>Sostener tazas ~ 27 ° c 5\u20127 días hasta que los mosquitos al oviposit completamente mientras que la mortalidad diaria de seguimiento. Contar huevos bajo un ámbito de disección.</li>
</ol>4. bioensayo de mortalidad y la oviposición de Musca domestica
<ol><li>Tres días después de la inyección, siguen las moscas con 10% de sacarosa y anote el número de moscas muertas visiblemente.</li>
	<li>Tres días después de la inyección, anestesiar a moscas, brevemente colocando un tubo de polietileno dosificación de CO2 sobre las copas de celebración hasta que todas las moscas son inmóviles en la parte inferior de las tazas.</li>
	<li>Transferencia vuela una jaula limpia, compuesto por un frasco de plástico de 4 L con una funda de punto que cubre la abertura (10 cm, figura 3B). Proporcionar moscas con agua y una mezcla de sacarosa granulada, leche en polvo y secó la yema de huevo en un 8: relación 8:1 (en volumen) durante cuatro días, grabar y quitar muerto vuela diariamente.</li>
	<li>Preparar los ingredientes secos por medio de cría larval mosca fresco mezclando 75% salvado de trigo con alimento por peso 25% peleteado para el ganado. Añadir agua hasta llegar a 62% de humedad (hasta que una gota de agua apenas puede ser exprimida hacia fuera).</li>
	<li>Preparar una bola de diámetro de 2.5 cm de una mezcla 1:1 de los anteriores medios larvas frescos y "utilizado" volar medio larval (medio en el que previamente han empupado moscas). Envolver la bola en un cuadrado de tela de algodón negro, apriete ligeramente hasta que el medio líquido se filtra a través y luego usar gomas para sujetar el paño en su lugar alrededor de la bola.</li>
	<li>Poner la bola en una copa de 60 mL y colocarlo en la jaula mosca de 5 horas (figura 3B).</li>
	<li>Enjuagar los huevos de la bola de oviposición y asegurar que los huevos se eliminan por debajo de los pliegues en la tela. Agite huevos para desarticular grupos y transferirlos a un tubo de centrífuga graduado de 20 mL con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Espere hasta que los huevos se colocan y tenga en cuenta el volumen de los huevos colocados en el tubo graduado. Añadir agua suficiente para llevar el volumen hasta 20 X el volumen de los huevos colocados. Registrar el volumen total de agua más huevos.</li>
	<li>Mientras se mezcla el agua y huevo suspensión con agitación vigorosa o una barra de agitación magnética, utilice una punta de la pipeta de 1 mL (con el extremo de la punta cortada) para dispensar 0.5 mL de la suspensión en un pedazo de paño negro previamente humedecido en una serie de líneas de agua y huevo. Contar los huevos con un microscopio de disección.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 dos veces más. Si una de las cuentas es un outlier severa (es decir, se diferencia de las otras dos cuentas por > 35%), hacer un recuento de cuarta y caso omiso de los aislados.</li>
	<li>Calcular el número promedio de huevos por muestra y multiplicar este valor por 2 para obtener el número de huevos/mL de la suspensión. Multiplicar el valor de huevos/mL obtenido por el volumen de la suspensión del huevo del paso 4.8. Se trata de la estimación para el número total de huevos puestos.</li>
</ol>

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</ol>

Todos los autores son empleados o contratistas del Departamento de agricultura de Estados Unidos o el Departamento de defensa. Este manuscrito fue producido durante el curso de deberes oficiales y es por la ley en el dominio público. Las opiniones expresadas representan la opinión de los autores y no representan una posición oficial o aprobación por el gobierno de Estados Unidos. Mención de un producto comercial no es una recomendación para su uso.

Microinyección es una técnica de laboratorio valiosa para asegurar el suministro de dsRNA u otros biorationals (es decir, pesticidas, virus, microsporidia). Mientras que muchos laboratorios realizan microinyección, la cantidad exacta que se inyecta es a menudo confusa debido a las limitaciones técnicas del sistema donde el volumen no es medido directamente11. Concentración y el volumen son parámetros críticos que permiten el cálculo de medidas estándares toxicológicas como CE50 o CL50 o definir la mínima eficaz dosis de5,16. Esto es especialmente importante en los estudios funcionales mediante RNAi en insectos adultos, donde entrega por alimentación no siempre resulta en la exposición sistémica a las partículas deseadas y la dosis real cruzando el intestino medio es claro5.
Mientras que el procedimiento de microinyección puede ser inicialmente difícil, rápidas mejoras en la precisión de velocidad y entrega se logran con práctica y paciencia. Dominar el procedimiento de la inyección es una inversión de tiempo, pero, una vez logrado, el procedimiento produce resultados repetibles y la mortalidad de la lesión de < 3%. La relación de las inyecciones de éxito aumentará competencia aumenta permitiendo la inyección de 300 mosquitos o moscas por día.
Muchos de los desafíos de la microinyección son debido a la aguja que se utiliza. Determinar el punto de quiebre de aguja capilar adecuada y el ángulo de punta es un aspecto difícil del procedimiento y requiere algún ensayo y error para determinar el tamaño de apertura más eficaz para una determinada especie. La aguja fina más útil para la microinyección de mosquito (~ 150 μm) es demasiado pequeña para entregar rápidamente el volumen más grande que se inyecta en moscas mientras que por el contrario, la aguja más grande apertura de que trabajos sobre moscas (250 μm) causa daño extenso de la lesión a los mosquitos más pequeños y mortalidad inaceptable de la inyección. Una aguja con una punta Roma es a menudo difícil de obtener a través de la cutícula sin daño tisular y aumento de la mortalidad. Insectos escamas o piezas de tejido pueden obstruir las agujas en el transcurso de un experimento, por lo que a menudo es útil tener varias agujas tiradas si es necesario reemplazar. Hemos encontrado que es más fácil reemplazar una aguja difícil en lugar de dedicar tiempo a tratar de limpiar una aguja atascada o defectuosa.
Observar la solución de la inyección en el insecto es fundamental para que las inyecciones pueden eliminarse (ver pasos 2.14 2.15). Rodamina B además soluciones de inyección ofrece una visual clara para asegurar que los insectos etapas de frío recibe la dosis correcta y es especialmente útiles mientras practicaba (ver paso 2.7).
Los métodos de bioensayo inyección y oviposición presentados aquí han inducido con éxito gene precipitación y medibles efectos fenotípicos en adultos de Ae. aegypti y M. domestica cuando usando los dsRNAs diseñado contra específicos ribosomal transcripciones (figura 4 y figura 5). Además, la capacidad de este método para proporcionar con precisión microvolúmenes a individuos permite curvas de dosis respuesta generar pequeñas cantidades de material (tan bajo como 50 ng; Figura 5B). Esto es especialmente útil para métodos como la detección de siRNAs o dsRNAs, como la producción de grandes cantidades de estas moléculas puede ser prohibitiva.
Este método puede ser modificado para inyectar agentes biológicos (virus, bacterias, microsporidia) o pesticidas químicos, después de asegurarse de que cualquier búferes de entrega son inocuos por inyección. Volumen de la entrega está limitado por el tamaño del insecto, produciendo concentrado soluciones de prueba es de importancia.
Evaluar la eficacia de dsARN adecuadamente, es necesario seguir oviposición como fenotipos letal sólo pueden manifestarse en la progenie. Tal como se presenta aquí, sosteniendo hembra Ae. aegypti por separado después de blooding permite determinación del tamaño del embrague individuales y pruebas adicionales en el mismo individuo pueden hacerse después del oviposition (es decir, estudios de expresión génica, adicional gonotrophic ciclos, caída específica de tejido) para correlacionar la reproducción con otras medidas como la expresión génica. M. domestica generalmente ovipositan en una respuesta del grupo, incitar a moscas grávidas aislados para poner es muy mano de obra intensiva y no es práctico para un gran número de individuos17. Por lo tanto, se presenta un método para determinar el tamaño promedio de la nidada.
El método de microinyección presentado proporciona entrega sistémica constante a los mosquitos y las moscas de casa. Junto con la mortalidad y la oviposición seguimiento pruebas biológicas, estas herramientas versátiles pueden utilizarse para evaluar los efectos transcripcionales y fenotípicos de pequeñas moléculas de ARN, agentes biológicos y pesticidas tradicionales donde la administración oral no es viable.

Entrega pequeñas biomoléculas, como los ácidos nucleicos, para dípteros adultos ha demostrado para ser un desafío en Culicidae y Muscidae. La absorción oral de dsARNs se ha divulgado para producir esterilidad (cuando dirigida exclusivamente a los genes expresados en los testículos de los adultos) y mortalidad (cuando se SNF7 y un coactivator del receptor esteroide) en larvas de Aedes aegypti1,2 . La mortalidad también se ha observado cuando se HSP70 en larvas de Musca domestica3. Sin embargo, tales efectos fenotípicos, no han resultado después de la alimentación dsARN a adultos de Ae. aegypti en azúcar comidas4,5.
Microinyección ha sido utilizado para burlar el midgut introducción de patógenos o los ácidos nucleicos, así inducir una respuesta sistémica5,6,7,8,9,10 . Existen varias técnicas de microinyección, con equipos que van desde aparatos producidos interna que requieren medición visual del volumen de inyección a los inyectores controlados por microprocesador que permiten la entrega automatizada de volúmenes tan bajos como 2,3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA de interferencia (ARNi) disparadores a mRNAs ribosomal, interrumpir el desarrollo ovárico en artrópodos tan diversos como la garrapata Rhipicephalus microplus, los mosquitos Aedes aegypti y Culex pipiens, y la mosca doméstica Musca domestica5,9,12,13. En estos estudios, la interrupción de oviposición de monitoreo era esencial para determinar la eficacia de los inoculantes el fenotipo puede manifestar como terminación o reducción de la progenie. Esta es una forma de fenotipo letal multigeneracional que es infectado de un efecto crítico y deseado en muchos de los métodos de control biológico no tradicionales como Wolbachia -introducción de los machos (incompatibilidad sexual) y ARNi inducida por esterilidad5 ,9,14. Seguimiento de la mortalidad y la fecundidad es necesaria para la caracterización y desarrollo de biorationals altamente específico (patógenos de origen natural o derivados naturales)15.
Este protocolo presenta técnicas de microinyección detallada para adultos mosquitos y moscas de la casa; un proceso que a menudo no está bien descrito en la literatura. Además, se describen métodos de bioensayo de oviposición para evaluar adecuadamente los efectos de dsARN en dípteros adultos. Estos protocolos fueron desarrollados específicamente para Aedes aegypti y Musca domestica pero pueden ser modificados para otras especies.

<table><tbody><tr><td><Tirador de > aguja fuerte>< </Tirador ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pipetas vertical</td><td>fuerte Kopf</td><td>720</td><td>ajustes: calentador = 15 unidades, solenoide = 4 amperios capilares de</td></tr><tr><td>vidrio, 3,5" de largo, ID = 0,530 mm &plusmn; 25 &mu; m, diámetro exterior 1,14 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504949</td><td>capilares para tirar de agujas de vidrio</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>estación de microinyectores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanolitro 2010</td><td>Micromanipulador manual de World Precision Instruments</td><td>NANOLITER2010</td><td>microinyector</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-L</td> brazo <td>izquierdo Manipulador KITE</td></tr> soporte <tr><td>magnético</td><td>World Precision Instruments</td><td>M9</td><td>sostiene micromanipulador microscopio</td></tr><tr><td>binocular de precisión con zoom estéreo en soporte de brazo</td> Visor de disección <td>PZMIII-BS de</td><td>World Precision Instruments</td><td>para microinyecciones</td></tr><tr><td>objetivo 1.5X</td><td>World Precision Instruments</td><td>501377</td><td>objetivo para microscopio</td></tr><tr><td>anillo de luz de</td><td>luz World Precision Instruments</td><td>504134</td> para inyección mesa de enfriamiento de laboratorio para <td>microscopio</td></tr><tr><td></td><td>BioQuip Products</td><td>1431</td><td>mesa de enfriamiento para microinyecciones</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>para insectos de estadificación mientras se inyectan</td></tr><tr><td>Rhodamine B, 98+%</td><td>Acros Organics</td><td>AC296571000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>bioensayos de oviposición de mosquitos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>para sostener portaobjetos de puesta en escena</td></tr><tr><td>vaso de plástico - 3 1/2 oz.</td><td>Dart Container Corporation</td><td>TK35</td><td>oviposición de mosquitos tazas de bioensayo tela de</td></tr><tr><td>tul mate</td><td>Joanne Fabrics</td><td>1103068</td><td>tapas para bioensayos de oviposición fuente de</td></tr><tr><td>sangre</td><td>adquirida</td><td></td><td>localmente, generalmente bovino o pollos vivos</td></tr><tr><td>1 x 30 mm tripa de colágeno comestible transparente</td><td>Butcher and Packer</td><td>30D02-05</td><td></td></tr><tr><td>papel</td> <td>de germinación de semillas de alto gramajeAnchor Paper Co</td><td>SD7615L</td><td></td></tr><tr><td>aspirador oral con filtro HEPA</td><td>John W. Hock Company</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>house fly oviposition bioassays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bote de plástico de almacenamiento de alimentos de 4 L</td><td>Walmart</td><td>555115143</td><td></td></tr><tr><td>funda de jersey de 10 pulgadas</td><td>Medonthego.com</td><td></td> salvado de trigo FS15001H <td></td></tr><tr><td></td><td>adquirido</td><td></td> localmente<td>, que generalmente se encuentra en las tiendas de alimentos</td></tr><tr><td>Suplemento de rendimiento de ternero Manna</td><td>ValleyVetSupply.com</td><td>16731</td><td>alimento para ganado peletizado</td></tr><tr><td>yema de huevo seca</td><td>BulkFoods.com</td><td>40506</td><td></td></tr><tr><td>tela de algodón negro</td><td>adquirida</td><td></td><td>localmente típicamente en la sección de suministros artesanales</td></tr><tr><td>taza de 60 mL</td><td>Dart Container Corporation</td><td>P200-N</td><td></td></tr></tbody></table>

dsrna reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

DsRNAs sintéticos, utilizados para inducir la interferencia de ARN, pueden tener efectos fenotípicos dependiente de la dosis. Estos efectos son difíciles de definir si los dsARNs se entregan mediante un método no cuantitativo. Entrega exacta de cantidades conocidas de los ácidos nucleicos u otros productos químicos es fundamental para medir la eficacia del compuesto sometido a prueba y para permitir una comparación fiable entre compuestos.
Aquí proporcionamos un protocolo reproducible, cuantitativa microinyección que asegura la entrega exacta de dosis específicas de dsRNA, reducción de la mortalidad normalmente inducida por la inyección de lesión. Estas modificaciones incluyen la adición de la RHODAMINA B, una aguja de inyección se graduó, y un método de recuperación mejorado tomado de Isoe y Collins. Este método permite el cálculo de respuestas dosis y facilita las comparaciones entre compuestos. Versiones de este método se han utilizado con éxito en tres géneros de mosquitos y moscas de la casa para evaluar la reducción en fecundidad resultantes de silenciamiento del gen de transcripciones de ARN ribosómico.
Este protocolo proporciona estrategias para reducir varios desafíos de microinyección de insectos pequeños. Junta, mecánica entrega de dsRNAs acompañado de una verificación visual, identificación de localizaciones efectivas para la entrega y la inclusión de un período de recuperación después de la inyección Asegúrese de dosificación precisa y lesiones baja mortalidad. Este protocolo también describe un bioensayo de oviposición para la determinación uniforme de efectos sobre la fecundidad.

Microinyección de dsARN en mosquitos
Este método de microinyección se ha utilizado en nuestro laboratorio para evaluar la expresión génica, mortalidad y respuesta de oviposición para más de 80 activaciones de dsRNA a través de varios géneros de mosquitos (Aedes, Anopheles, Culex). Inyectando a las hembras de la cepa de la colonia de Ae. aegypti (ORL1952) con 1 μg de dsRNA derivada de la transcripción ribosomal RPS6 y RPL26 (Estep et al. 5 métodos de producción de dsARN y datos de la secuencia) mostró significativa reducción en la expresión relativa (RE) a través de oviposición múltiples ciclos comparado con inyectado con un dsGFP de control de mosquitos. Aedes aegypti RE medido siguiendo el ciclo de gonotrophic de 2nd mostraron una reducción significativa de la expresión RPS6 (P &lt; 0,05) en los mosquitos inyectados con dsRPS6 según lo determinado por la prueba t de estudiante entre el control dsGFP del mismo grupo (figura 4)5 .
Se evaluó la fecundidad de las hembras individuales mediante el bioensayo de oviposición que se describe aquí. Después de la inyección después de 3 días, los mosquitos eran sangre alimentados, transferidos en contenedores de oviposición individuales y permitió poner a la terminación. Tamaños del embrague promedio para el primer ciclo de gonotrophic se redujeron significativamente para ambas dsRPS6 tratada Ae. aegypti (n = 102 hembras, 1,3 ± 0.8 (media ± SE) huevos) y dsRPL26 tratados (n = 86 hembras, 4,0 ± 1.1 huevos) en comparación con las inyecciones de dsGFP (n = 79 hembras, 49,3 ± 3.5 huevos, figura 5A). Evaluación de embrague después de un segundo ciclo de gonotrophic también demostró oviposición redujo significativamente en ambos grupos Tratado de dsRNA, pero con tamaño reducido efecto. Tamaños de grupo de Ae. aegypti fueron variables y así separación de medias se realizó por Dunn test5. Mortalidad de la veinte-cuatro-hora era normalmente el 3% o menos.
Se observó un efecto claro de la dosis cuando la inyección de dsRPS6 de 1 μg a 50 ng en hembra de Ae. aegyptiy tamaño de la nidada varió significativamente en comparación con controles 1 dsGFP μg/hembra inyecta en todos pero la dosis de dsRPS6 de 25 ng/hembra (figura 5B).
Microinyección de dsARN en casa vuela
Colonia Musca domestica (ORL normal) fueron inyectados con 5 μg de dsARN construcciones diseñado contra la mosca de casa RPS6 y RPL26 transcripciones9. Como se observó en Ae. aegypti, reducción significativa de la expresión de transcripción específicos tanto (RPS6 y RPL26) y reducción en el tamaño de la nidada se observan (figura 4 y figura 5). Reducción significativa en RE se determinó mediante la prueba t de Student entre el control dsGFP del mismo grupo (P &lt; 0.05) y se empleó el test de Holm-Sidak para determinar significación entre los tamaños del embrague de M. domestica de diferentes grupos de tratamiento. Disecciones ováricas demostraron Oogénesis reducida en tratamientos dsRPS6 y dsRPL26, mientras que dsGFP alimentado con moscas deposición de vitelogenina normal según la clasificación en la escala de Tyndale-Biscoe9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig1.jpg"> Figura 1: configuración de microinyección para entregar microvolúmenes adultos mosquitos y moscas de casa. Las inyecciones se realizan en lugar el portaobjetos sobre una mesa chill de insectos anestesiados por el frío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig2.jpg"> Figura 2: Sitios de microinyección para Ae. aegypti y M. domestica. (A) adultos de Ae. aegypti se inyectan en el tercio medio de la mesokatepisternum. (B) adulto de M. domestica se inyectan en el mesopleuron. Las flechas indican los sitios de inyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig3.jpg"> Figura 3: configuración de la prueba biológica de oviposición. (A) ensayo de oviposición de Ae. aegypti tazas con el papel de germinación de semillas como un substrato de oviposición, con tul y 10% algodón empapado de sacarosa. (B) adulto hembra M. domestica en un recipiente de ensayo de oviposición con alimentos (A), agua (B) y larvas medios (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig4.jpg"> Figura 4: Expresión relativa de RPS6 Ae. aegypti y M. domestica inyectada dsARNs específicos. Aedes aegypti y M. domestica fueron inyectados con 1 y 5 μg respectivamente de cualquier control de dsRNA (dsGFP) o dsRNA diseñado contra RPS6 o RPL26 transcripciones de cada insecto. Reducción significativa (P &lt; 0,05) de RPS6 expresión fue observada en los mosquitos y moscas inyectados con dsRPS6 y por las moscas inyectados con dsRPL26 (indicado por asteriscos). Barras de error representan la media ± SE y número en la base de la columna indica el número de individuos examinados. Esta figura ha sido modificada de Estep et al. 5 y Sanscrainte et al. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig5.jpg"> Figura 5: Tamaño promedio de Ae. aegypti y M. domestica inyectada dsARNs específicos. (A) deposición de huevo se redujo significativamente (P &lt; 0,05) en Ae. aegypti y M. domestica después de la inyección de 1 y 5 μg respectivamente de cualquier control de dsRNA (dsGFP) o dsRNA diseñado contra RPS6 o RPL26 transcripciones de cada insecto. Los asteriscos indican diferencias significativas desde el control de dsGFP del mismo grupo. Barras de error representan la media ± SE y número en la base de la columna indica el número de individuos examinados. Esta figura ha sido modificada de Estep et al. 5 y Sanscrainte et al. 9. (B) curva de dosis de Ae. aegypti inyectados con dsRPS6 de 50 ng/hembra a 1000 ng/mujer muestra reducciones significativas en fecundidad en comparación con cohortes dsGFP inyectado (50, 100 y 1000 ng/mujer). Barras de error representan la media ± IC del 95% de organismos individuales 36-81 por dosis. Puntos con las letras representan diferencia significativa entre grupos (P &lt; 0,05) identificado por ANOVA. Esta figura ha sido modificada de Estep et al. 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biopesticida, como cómo la expresión génica de impacto del ARN de doble cadena y la fecundidad en los dipteranes adultos. La principal ventaja de esta técnica es que las dosis cuantificables de ARN de doble cadena se entregan al mosquito o a la mosca, y los efectos resultantes en la letalidad multigeneracional pueden evaluarse. Aunque este método se presenta para el mosquito, aedes aegypti, y la mosca de la casa, musca domestica, también se puede aplicar a otras especies de mosquitos y moscas.Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán, porque dominar el procedimiento de inyección en sí es una inversión de tiempo. Inyectar cada insecto con el tamaño óptimo de la punta de la aguja es fundamental para asegurar el parto y minimizar las lesiones y la mortalidad. Para comenzar, utilice fórceps para escenificar cuidadosamente a los mosquitos para que finalmente se expongan en un portaobjetos de microscopio aproximadamente a medio centímetro de distancia.Para facilitar el manejo de diapositivas, deje un espacio de uno a uno centímetro en el extremo izquierdo o derecho de la diapositiva. A continuación, coloque el tobogán de insectos escenificados a cuatro grados centígrados en un plato grande de petri. Configure un microscopio de disección y un microinyector sobre una mesa fría.Después de tirar de los capilares de vidrio a una punta fina, coloque la aguja capilar en el microinyector y rompa la punta de la aguja con fórceps. A continuación, enjuague la aguja dibujando y expulsando el agua libre de nucleasas tres veces. Tenga en cuenta que los tamaños de abertura de agujas de vidrio varían entre los mosquitos y las moscas de la casa.A continuación, prepare una solución inyectable con una concentración adecuada para los mosquitos. Añadir tres microgramos por mililitro de Rhodamine B a la solución para ayudar en la visualización. Utilice una pipeta para transferir de tres a cuatro microlitros de solución a una superficie limpia y extraerla en la aguja de vidrio sin tomar ningún aire.Presione el botón de inyección repetidamente hasta que el líquido comience a dispensar de la aguja. Utilice un marcador de punto ultra fino para dibujar marcas de hachís a un milímetro de distancia, desde el menisco líquido hasta el vástago de la aguja. Ajuste el portaobjetos de los mosquitos debajo de la aguja y asegúrese de que el campo de visión sea lo suficientemente ancho como para ver el menisco de solución en la aguja.Alinee la aguja con el medio un tercio del esternón mesocarape. Apriete el mosquito contra la aguja con fórceps colocados en el lado opuesto del mosquito, y perfore suavemente la cutícula con la punta de la aguja. Deslice suavemente la aguja dentro del mosquito hasta que la punta haya pasado a través de la línea media.Presione el botón de inyección hasta que se haya inyectado la cantidad deseada de líquido. Si el menisco no se mueve, deslice lentamente el mosquito o vuele de la aguja mientras observa el movimiento del menisco. Si una parte de las perlas de la solución inyectada sale de la cutícula al retirar la aguja, o si el menisco no se mueve, deseche el insecto ya que la inyección no tuvo éxito.En la mosca de la casa, alinee la aguja con el mesopleuron. Apriete la mosca contra la aguja con fórceps colocados en el lado opuesto de la mosca, y perfore suavemente la cutícula con la punta de la aguja. Transfiera los insectos inyectados para limpiar las tazas de retención de 3.5 onzas en grupos de diez a 15.A continuación, cubra la taza con mallas y dé las que se recuperen a temperatura ambiente. Después de que los insectos se hayan recuperado, invierta la taza de sujeción sobre una bola de algodón empapada en una solución de 10%sacarosa. Primero, llene una membrana artificial de 12 pulgadas con sangre fresca y caliente a 60 grados Celsius en un baño de agua caliente.Seque la membrana con una toalla de papel y acuétela a través de la tapa de la taza de sujeción. Después de que los mosquitos se alimenten, reemplace la bola de algodón y deje que los mosquitos descansen durante 24 horas. A continuación, construya tazas de oviposición llenando vasos claros de bio-acetato de 3.5 onzas con aproximadamente 30 milímetros de agua desionizada.A continuación, coloque un trozo de papel de germinación de semillas en la parte inferior de la copa. Cubra la copa con malla y corte una pequeña hendidura en la tapa de la red. 24 horas después de la alimentación, cortar una pequeña hendidura en la tapa de la taza de sujeción y transferir a las hembras que se alimentan con éxito a tazas de oviposición.A continuación, selle la pequeña hendidura en la tapa de oviposición con una bola de algodón saturado de 10% sacarosa. Vigilar los mosquitos y realizar un seguimiento de la mortalidad diaria. Después de permitir que los mosquitos oviposit durante cinco a siete días, cuente los huevos bajo un microscopio diseccionando.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Christopher Geden, un Entomólogo de Investigación del USDA ARS. Tres días después de la inyección, anestesia las moscas con dióxido de carbono. A continuación, transferir las moscas a una jaula limpia con agua y la dieta de mosca preparada.Registre los datos de mortalidad y elimine las moscas muertas diariamente. A continuación, mezclar 75%salvador de trigo con 25% de pienso de stock vivo peletizar en peso para preparar el medio de cría larval. Añadir agua a la mezcla hasta que se logre un 62% de humedad.Agregue la mezcla de alimento de salvado de trigo humedecido a un cuadrado de tela negra, y rodar en una bola. Use una banda de goma para mantener el paño en su lugar, y apriete suavemente hasta que el medio líquido se seeps a través. Coloque la pelota en una taza de 60 mililitros y colóquela en la jaula de la mosca durante cinco horas.Después de esto, enjuague los huevos de la bola, asegurándose de que los huevos se retiran de debajo de los pliegues de la tela. Agitar los huevos para interrumpir cualquier racimo, y transferirlos a un tubo de centrífuga graduada de 20 mililitros. Deje que los huevos se asienten y anote el volumen de huevos asentados en el tubo.A continuación, agregue suficiente agua para llevar el volumen a 20 veces el volumen de los huevos asentados. A continuación, utilice una barra de agitación magnética para mezclar el agua y la suspensión del huevo. Por último, utilice una punta de pipeta modificada para dispensar 0,5 mililitros de la suspensión sobre un trozo de tela negra prehumedecido en una serie de líneas.En este protocolo, se micro inyectaron mosquitos hembra para evaluar la expresión génica. La inyección de hembras con ARN de doble hebra mostró una reducción significativa en la expresión relativa en múltiples ciclos de oviposición. Los tamaños medios de embrague en mosquitos en el primer ciclo gonotrófico se redujeron significativamente para los grupos tratados con dsRPS6 y dsRPL26.Se observó un efecto de dosis evidente en el tamaño del embrague al inyectar dsRPS6 de un microgramo a 50 nanogramos en mosquitos hembra. Las moscas de la casa también fueron inyectadas con cinco microgramos de construcciones de ARN de doble cadena. Al igual que las observaciones de mosquitos, se observó una reducción significativa tanto en la expresión de transcripción específica como en el tamaño del embrague.Al intentar este procedimiento, es importante recordar descartar insectos que no se inyectaron con éxito. Mediante este procedimiento, cualquier construcción de ARN de doble cadena u otra biorracional puede ser entregada a mosquitos o moscas. No olvide que trabajar con agujas de vidrio puede ser peligroso, y siempre deben eliminarse en contenedores de residuos adecuados para objetos punzantes.

reproducible-dsrna-microinjection-oviposition-bioassay-mosquitoes

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Investigación

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La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

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DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

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