DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biopesticida, como cómo la expresión génica de impacto del ARN de doble cadena y la fecundidad en los dipteranes adultos. La principal ventaja de esta técnica es que las dosis cuantificables de ARN de doble cadena se entregan al mosquito o a la mosca, y los efectos resultantes en la letalidad multigeneracional pueden evaluarse. Aunque este método se presenta para el mosquito, aedes aegypti, y la mosca de la casa, musca domestica, también se puede aplicar a otras especies de mosquitos y moscas.

Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán, porque dominar el procedimiento de inyección en sí es una inversión de tiempo. Inyectar cada insecto con el tamaño óptimo de la punta de la aguja es fundamental para asegurar el parto y minimizar las lesiones y la mortalidad. Para comenzar, utilice fórceps para escenificar cuidadosamente a los mosquitos para que finalmente se expongan en un portaobjetos de microscopio aproximadamente a medio centímetro de distancia.

Para facilitar el manejo de diapositivas, deje un espacio de uno a uno centímetro en el extremo izquierdo o derecho de la diapositiva. A continuación, coloque el tobogán de insectos escenificados a cuatro grados centígrados en un plato grande de petri. Configure un microscopio de disección y un microinyector sobre una mesa fría.

Después de tirar de los capilares de vidrio a una punta fina, coloque la aguja capilar en el microinyector y rompa la punta de la aguja con fórceps. A continuación, enjuague la aguja dibujando y expulsando el agua libre de nucleasas tres veces. Tenga en cuenta que los tamaños de abertura de agujas de vidrio varían entre los mosquitos y las moscas de la casa.

A continuación, prepare una solución inyectable con una concentración adecuada para los mosquitos. Añadir tres microgramos por mililitro de Rhodamine B a la solución para ayudar en la visualización. Utilice una pipeta para transferir de tres a cuatro microlitros de solución a una superficie limpia y extraerla en la aguja de vidrio sin tomar ningún aire.

Presione el botón de inyección repetidamente hasta que el líquido comience a dispensar de la aguja. Utilice un marcador de punto ultra fino para dibujar marcas de hachís a un milímetro de distancia, desde el menisco líquido hasta el vástago de la aguja. Ajuste el portaobjetos de los mosquitos debajo de la aguja y asegúrese de que el campo de visión sea lo suficientemente ancho como para ver el menisco de solución en la aguja.

Alinee la aguja con el medio un tercio del esternón mesocarape. Apriete el mosquito contra la aguja con fórceps colocados en el lado opuesto del mosquito, y perfore suavemente la cutícula con la punta de la aguja. Deslice suavemente la aguja dentro del mosquito hasta que la punta haya pasado a través de la línea media.

Presione el botón de inyección hasta que se haya inyectado la cantidad deseada de líquido. Si el menisco no se mueve, deslice lentamente el mosquito o vuele de la aguja mientras observa el movimiento del menisco. Si una parte de las perlas de la solución inyectada sale de la cutícula al retirar la aguja, o si el menisco no se mueve, deseche el insecto ya que la inyección no tuvo éxito.

En la mosca de la casa, alinee la aguja con el mesopleuron. Apriete la mosca contra la aguja con fórceps colocados en el lado opuesto de la mosca, y perfore suavemente la cutícula con la punta de la aguja. Transfiera los insectos inyectados para limpiar las tazas de retención de 3.5 onzas en grupos de diez a 15.

A continuación, cubra la taza con mallas y dé las que se recuperen a temperatura ambiente. Después de que los insectos se hayan recuperado, invierta la taza de sujeción sobre una bola de algodón empapada en una solución de 10%sacarosa. Primero, llene una membrana artificial de 12 pulgadas con sangre fresca y caliente a 60 grados Celsius en un baño de agua caliente.

Seque la membrana con una toalla de papel y acuétela a través de la tapa de la taza de sujeción. Después de que los mosquitos se alimenten, reemplace la bola de algodón y deje que los mosquitos descansen durante 24 horas. A continuación, construya tazas de oviposición llenando vasos claros de bio-acetato de 3.5 onzas con aproximadamente 30 milímetros de agua desionizada.

A continuación, coloque un trozo de papel de germinación de semillas en la parte inferior de la copa. Cubra la copa con malla y corte una pequeña hendidura en la tapa de la red. 24 horas después de la alimentación, cortar una pequeña hendidura en la tapa de la taza de sujeción y transferir a las hembras que se alimentan con éxito a tazas de oviposición.

A continuación, selle la pequeña hendidura en la tapa de oviposición con una bola de algodón saturado de 10% sacarosa. Vigilar los mosquitos y realizar un seguimiento de la mortalidad diaria. Después de permitir que los mosquitos oviposit durante cinco a siete días, cuente los huevos bajo un microscopio diseccionando.

Demostrando el procedimiento estará el Dr. Christopher Geden, un Entomólogo de Investigación del USDA ARS. Tres días después de la inyección, anestesia las moscas con dióxido de carbono. A continuación, transferir las moscas a una jaula limpia con agua y la dieta de mosca preparada.

Registre los datos de mortalidad y elimine las moscas muertas diariamente. A continuación, mezclar 75%salvador de trigo con 25% de pienso de stock vivo peletizar en peso para preparar el medio de cría larval. Añadir agua a la mezcla hasta que se logre un 62% de humedad.

Agregue la mezcla de alimento de salvado de trigo humedecido a un cuadrado de tela negra, y rodar en una bola. Use una banda de goma para mantener el paño en su lugar, y apriete suavemente hasta que el medio líquido se seeps a través. Coloque la pelota en una taza de 60 mililitros y colóquela en la jaula de la mosca durante cinco horas.

Después de esto, enjuague los huevos de la bola, asegurándose de que los huevos se retiran de debajo de los pliegues de la tela. Agitar los huevos para interrumpir cualquier racimo, y transferirlos a un tubo de centrífuga graduada de 20 mililitros. Deje que los huevos se asienten y anote el volumen de huevos asentados en el tubo.

A continuación, agregue suficiente agua para llevar el volumen a 20 veces el volumen de los huevos asentados. A continuación, utilice una barra de agitación magnética para mezclar el agua y la suspensión del huevo. Por último, utilice una punta de pipeta modificada para dispensar 0,5 mililitros de la suspensión sobre un trozo de tela negra prehumedecido en una serie de líneas.

En este protocolo, se micro inyectaron mosquitos hembra para evaluar la expresión génica. La inyección de hembras con ARN de doble hebra mostró una reducción significativa en la expresión relativa en múltiples ciclos de oviposición. Los tamaños medios de embrague en mosquitos en el primer ciclo gonotrófico se redujeron significativamente para los grupos tratados con dsRPS6 y dsRPL26.

Se observó un efecto de dosis evidente en el tamaño del embrague al inyectar dsRPS6 de un microgramo a 50 nanogramos en mosquitos hembra. Las moscas de la casa también fueron inyectadas con cinco microgramos de construcciones de ARN de doble cadena. Al igual que las observaciones de mosquitos, se observó una reducción significativa tanto en la expresión de transcripción específica como en el tamaño del embrague.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar descartar insectos que no se inyectaron con éxito. Mediante este procedimiento, cualquier construcción de ARN de doble cadena u otra biorracional puede ser entregada a mosquitos o moscas. No olvide que trabajar con agujas de vidrio puede ser peligroso, y siempre deben eliminarse en contenedores de residuos adecuados para objetos punzantes.