Name: Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar la salida de leucocitos desde tumores cutáneos en ratones transgénicos Kaede mediante fotoconversión in vivo. Este método permite rastrear poblaciones endógenas de células inmunes y analizar su dinámica mediante citometría de flujo.

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Los autores desean agradecer a Dr. Marcus Bosenberg por prever líneas de melanoma murino YUMM 1.7 y 1.1 YUMM y Dr. Deborah J. Fowell proporcionando B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) ratones 15Utr acuerdo con RIKEN BRC a través de los Bio-recursos nacionales de MEXT, Japón.

Animales todos los protocolos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Oregon Health & Science University.
1. inducción de la inflamación y FITC pintura del pabellón de oreja de ratón
<ol><li>En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado (inducir en el isofluorane 3-5% y se mantiene a 1-3% isofluorane; tasa de flujo de oxígeno en 0.5-1.0 L/min). Asegurar adecuada anestesia mediante el control de la pérdida del reflejo pedal, movimientos involuntarios y la reducción de la frecuencia respiratoria.</li>
	<li>Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de solución de FITC 5% disuelto en acetona 1:1: dibutil ftalato (DBP) en el lado ventral del pabellón auricular del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.</li>
	<li>24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones mediante exposición de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical. Recoger el sistema del oído en PBS separando las orejas de la cabeza con unas tijeras. Recoge las dLNs cervical y LNs no drenaje inguinal en PBS con unas pinzas para separar el LNs de los tejidos circundantes. LNs no drenaje inguinal servirá como controles negativos para la presencia de leucocitos de /Kaede rojo+ +de FITC. Dispone de canales según el protocolo institucional. Nota: El tiempo óptimo post photoconversion para el análisis dependerá el tipo de células y comportamientos migratorios conocidos. Las células dendríticas, por ejemplo, pueden detectarse en dLNs tan pronto como la aplicación de 6 h post DBP.</li>
</ol>2. inducción de la inflamación y Photoconversion del pabellón de oreja de ratón
<ol><li>En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón de Kaede-Tg (fondo C57Bl/6) por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg ketamina y xilacina de 10 mg/kg disuelta en solución salina. Asegurar adecuada anestesia como se describe en el paso 1.1.</li>
	<li>Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de un 1:1 acetona: DBP al lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.</li>
	<li>Después de la aplicación de la DBP, corte una ranura en un trozo de papel de aluminio y tire de la oreja a través de la ranura para exponer el oído a la fuente de luz violeta. Pone la oreja plana con el lado dorsal hacia arriba usando cinta de doble cara para asegurar el oído a la hoja.</li>
	<li>Coloque el oído directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert de 3 minutos utilizando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 100 mW.</li>
	<li>24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones de Kaede-Tg y cosechar los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3. Nota: Además de consideraciones citadas en el paso 1.3, las tasas de proliferación determinará el tiempo de análisis como la pérdida de Kaede rojo ocurrirá en rápidamente dividir las células.</li>
</ol>3. vacuna infección de oreja de ratón y aplicación de FITC
<ol><li>Anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.</li>
	<li>Coloque el lado ventral de la oreja plana. Pipeta 5 x 106 unidades de placa-formación (PFU) del virus vaccinia (VacV) diluido en 10 μl de PBS en el pabellón de la oreja. Utilizando una aguja de calibre 29, asoman la oreja 25 veces40.</li>
	<li>infección después de 24 h, anestesiar ratones infectados VacV con isofluorane como se describe en el paso 1.1 y pipetee 20 μl 5% FITC disuelto en acetona en el lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.</li>
	<li>24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones y recoger los pabellones del oído, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3. Nota: FITC se puede aplicar en cualquier momento punto post infección determinar DC tráfico a diferentes intervalos de 24 h. Hemos divulgado previamente que migración de DC a dLNs se mantiene en niveles similares desde el día 1 a 3 post infección41.</li>
</ol>4. vacuna infección de oreja de ratón y Photoconversion.
<ol><li>Anestesiar un ratón de Kaede-Tg con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.</li>
	<li>Infectar la oreja oreja con VacV como se describe en el paso 3.2.</li>
	<li>24 h post infección, anestesiar ratones infectados VacV Kaede como se describe en el paso 2.1 y realizar photoconversion como se describe en los pasos 2.3-2.4.</li>
	<li>24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones y los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal de la cosecha como se describe en el paso 1.3. Nota: Como se mencionó anteriormente en el paso 3.4, photoconversion puede ser administrada en cualquier infección de post de punto de tiempo.</li>
</ol>5. oído y nodo de linfa por citometría de flujo
<ol><li>Crear las suspensiones celulares solo de pabellones de la oreja: aparte pelar los lados dorsales y ventrales de la oreja del oído con dos pares de pinzas y el lugar en el interior de la oreja hacia abajo en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en Tampón salino solución (HBSS de Hank) (contiene Ca2 + y Mg2 +). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.</li>
	<li>Crear las suspensiones celulares solo de LNs: colocar LNs en pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Tease Abra el nodo de linfa la cápsula usando dos agujas de calibre 29 y luego incubar los nodos de linfa a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.</li>
</ol>6. intradérmica Melanoma Tumor implantación y Photoconversion.
<ol><li>Afeitarse la piel desde el centro de la espalda de un ratón de Kaede-Tg use una afeitadora eléctrica.</li>
	<li>Coloque una aguja de calibre 29 en el centro de la espalda entre los omóplatos de la izquierda y superiores derecha e inyectar por vía intradérmica 5 x 105 células del tumor (diluidas en 50 μl de solución salina) en la piel de ratones de Kaede-Tg. Los tumores deben colocarse cuidadosamente para asegurar drenaje linfático a los ganglios especificados (es decir, izquierda y derecha braquial LNs para tumores colocado en medio de la espalda). Evite colocar el tumor encima de dLN como esto puede resultar en photoconversion directo del LNs a través del piel, tumor.</li>
	<li>Permitir que los tumores a crecer al tamaño deseado (100-650 mm3).</li>
	<li>Un día antes de la recogida de tejido, anestesiar un ratón de Kaede-Tg como se describe en 2.1 y afeite cualquier recién regrown piel alrededor del tumor.</li>
	<li>Corte un agujero circular en papel de aluminio y sacar el tumor a través de exponer el tumor a la fuente de luz. Corte el agujero ligeramente más pequeño que el tumor para evitar que el tumor de volver a caer por el agujero y minimizar la conversión de la piel adyacente, no tumor.</li>
	<li>Coloque el tumor directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert durante 5 minutos usando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 200 mW.</li>
	<li>24 h después de la photoconversion, eutanasia los ratones como se describe en el paso 1.3. Recoger el LNs no drenaje inguinal, tumores y dLNs braquial en PBS. Corte los tumores de la piel circundante con unas tijeras y retire LNs como se describe en el paso 1.3.</li>
</ol>7. tumor y ganglios linfáticos por citometría de flujo
<ol><li>Crear las suspensiones celulares solo de los tumores: picar los tumores con las tijeras en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Incubar a 37 ° C por 1 h. Presione el tejido digerido a través de un filtro de nylon de 70 μm.</li>
	<li>Crear suspensión unicelular de los ganglios linfáticos como se describe en el paso 5.2.</li>
</ol>8. anticuerpos para citometría de flujo
<ol><li>Después de digerir los tejidos en suspensiones celulares individuales, realizar técnicas de tinción estándar flujo cytometry para etiquetar las células con marcadores de interés. Brevemente, pipeta 2 x 106 células en una placa de 96 pocillos. Incubar las muestras con el bloque Fc (1 μg/mL) durante 20 min sobre hielo; lavar dos veces con tampón FACs (1% albúmina de suero bovino en PBS). Añadir mancha live/dead (diluida en PBS) a las muestras e incubar durante 15 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs. Incubar con anticuerpos primarios (Tabla de materiales) diluidos en tampón FACs durante 30 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs. Nota: Kaede verde y Kaede fluorescencia roja se superpone con fluoróforos FITC y PE; por lo tanto, FITC y anticuerpos conjugados con PE no pueden utilizarse en combinación con proteínas de Kaede.</li>
	<li>Después de la tinción, ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Por otra parte, fijar las células con 2% PDA.</li>
</ol>9. Análisis de citometría de flujo de
<ol><li>Establece el FITC (Kaede verde) y PE (Kaede rojo) canal voltajes PMT en 70-80% de la escala total (centro de población en aproximadamente 104) utilizando ex vivo Kaede verde o rojo de Kaede solo color esplenocitos o sangre. Nota: No compensan el Kaede verde (FITC) y canales de Kaede rojo (PE) ya que ello en señal de mayor extensión.<ol>
<li>Para crear controles de Kaede solo-color, recoger un bazo o sangre de un ratón de Kaede-Tg. Lisar los glóbulos rojos con tampón de ACK, entonces las células se dividen en dos grupos: instruido Kaede Kaede verde y se convierte rojo.</li>
		<li>Para el solo color Kaede controles rojo, suspender las células en 1 mL de PBS y photoconvert en una placa de 24 pocillos para 5 min utilizando las fuentes de luz a 405 nm con una potencia de 100 mW. Utilizar estas células para establecer el Kaede verde (FITC) y Kaede rojo voltajes PMT en el citómetro de flujo (paso 9.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez las tensiones para las proteínas de Kaede, compensar todas las otras manchas de anticuerpo primario utilizando solo-fluoróforo etiquetado como cuentas de compensación por las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Ejecutar los ejemplos en un citómetro de flujo para recopilar datos. Nota: La proteína de Kaede continuamente está siendo producida por las células. Esto significa que 24 h después de photoconversion, se puede convertir células será doble positivo para Kaede verde y Kaede rojo como Kaede recién sintetizada (verde) proteína ha acumulado en la celda.</li>
	<li>Analizar los datos mediante software FlowJo o un software similar.</li>
</ol>

Los autores no tienen de revelar los conflictos.

Aunque la salida de leucocitos de los tejidos periféricos, no-linfoides es crítica para la iniciación y resolución de la respuesta inmune, los mecanismos moleculares que rigen la salida son poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento es en gran parte debido a la disponibilidad lista de herramientas para la cuantificación in vivo. Aquí, describimos el uso de ratones photoconvertible (Kaede-Tg) para cuantificar la salida de leucocitos endógena de la piel y tumores y proporcionar una comparación directa cara a c...

Las respuestas inmunitarias de tejido periférico están conformadas no sólo por el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación, sino también por los mecanismos que regulan su retención posterior. Por lo tanto, inmunidad protectora es dictada por acumulativos mecanismos celulares y moleculares que determinan si entra a un leucocito, permanece dentro, o más bien emigra de tejido periférico vía los recipientes linfáticos. Lo importante es la propensión de leucocitos al tejido a través de vasos linfáticos (denominada salida) la salida está ligada a sus funciones especializadas. Las células dendríticas (DC) adquieran comportamiento migratorio en respuesta a señales de maduración conduce al transporte del antígeno y presentación en el drenaje de los ganglios linfáticos (dLN), un proceso que es necesario para la inmunidad adaptativa1. Barrido de las células mieloides, tales como los macrófagos y neutrófilos, sirven para limpiar escombros de apoptosis a través de la fagocitosis. Durante una infección bacteriana, neutrófilos salida del tejido y en última instancia sufren apoptosis en dLNs2 y en un modelo de colitis inducida por DSS, datos apoyan la hipótesis de que la salida de macrófagos es necesaria para resolver la inflamación local3. Si se produce la salida de neutrófilos y macrófagos en todos los contextos inflamatorios, sin embargo, se desconoce. Evidencia de la salida de linfocitos T de estado estacionario4,5,6,7, infectados8y inflamada4,9,10, 11,12 los tejidos no-linfoides, periférico indica que las células T se recirculan activamente, aunque mal entendidas las señales basadas en el tejido que esta salida. Varios estudios han identificado las señales necesarias para la migración direccional hacia los capilares linfáticos de drenaje y posterior salida incluyendo chemokine (C-C motif) ligando 21 (CCL21) y su receptor CCR74,11, 13, ligando de chemokine (adorno de C-X-C) 12 (CXCL12) y su receptor CXCR42,14y esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Sin embargo, estos mecanismos no están activos en todos los contextos, y si determinan la salida de todos los tipos de la célula sigue siendo una incógnita. Lo importante, más penetración en los mecanismos que rigen la salida y su relevancia funcional en la enfermedad requiere cuantitativa en vivo métodos de análisis.
Varios métodos se han utilizado para cuantificar la salida en varios modelos animales en vivo , incluyendo la canulación directa de los vasos linfáticos, transferencia adoptiva de ex vivo etiquetados leucocitos, aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, inyección de partículas marcadas y en vivo photoconversion17,18. La canulación directa de los vasos linfáticos aferentes ratón es difícil y limitado en pequeños animales por los volúmenes de líquido que puede ser acumulado. Así, la canalización se ha realizado en gran parte en grandes animales (e.g., ovejas) donde tales manipulaciones quirúrgicas son prácticas. Estos estudios proporcionan evidencia directa de la presencia de células linfoides y mieloides en linfa10,19,20. Además, ovinos modelos revelan que la inflamación aguda y crónica incrementaron la presencia de linfocitos en los ganglios linfáticos casi 100-fold10,21.
Transferencia adoptiva de linfocitos genéticamente manipulados y etiquetados ha revelado lo importante que CCR7 se requiere para la salida de CD4+ T de las células de la piel agudo inflamada5,11, mientras que el tratamiento previo de los linfocitos con la pequeña molécula agonista de receptor de S1P, FTY720, inhibe parcialmente su salida10. Curiosamente, la salida de linfocitos transferidos de piel crónicamente inflamada es CCR7-independiente10, pero puede requerir parcialmente CXCR49. Experimentos de transferencia adoptiva, sin embargo, entregan a números no fisiológica de ex vivo los linfocitos activados y etiquetados en tejido a través de la inyección, que altera el ambiente biomecánico de los tejidos y elevadas presiones de fluido intersticiales abrir los capilares linfáticos iniciales y alterar sus propiedades de transporte22. Como alternativa, aplicación transdérmica de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en la presencia o ausencia de irritantes cutáneos (por ej., ftalato de dibutilo, DBP) o infección23,24 permite el seguimiento de los células fagocíticas que acumulan tracer y migran a dLNs. Del mismo modo, fluorescencia etiquetados tumores proporcionan un medio para rastrear las células fagocíticas que han engullido tumor material25. Estos métodos han proporcionado importante información sobre los mecanismos que gobiernan DC salida13,14,17,26,27 pero son incapaces de seguir no fagocíticas los linfocitos y, la interpretación se pueden complicar por drenaje linfático libre de FITC soluble así etiquetado no migratorias, DCs residente LN.
Por otra parte, la microscopia intravital es una poderosa herramienta que permite el seguimiento en vivo de las poblaciones de leucocitos fisiológicamente relevante en tiempo real28,29. Se usa en combinación con los ratones de reportero y basados en anticuerpos en vivo inmunofluorescente etiquetado intravital microscopía ha puesto de manifiesto el complejo espacial y dinámica temporal de inmune celular trata de personas, incluyendo migración intersticial30 , transmigración a través del endotelio linfático, pasaje dentro de la luz linfática y la migración a LN entrada28,31. Amplia adopción de técnicas de imagen intravital está limitado por el costo, conocimientos necesarios para la instalación y limitado rendimiento para la cuantificación de múltiples tipos de células. Todavía, acoplamiento de métodos cuantitativos que analizan la dinámica de la población los tejidos con la proyección de imagen intravital proporcionará visión mecanicista adicional e importante con respecto a los mecanismos de la movilidad y la migración hacia y dentro de los capilares linfáticos 18 , 31 , 32.
En consecuencia, photoconversion en vivo se ha convertido en un método que permite en situ etiquetado, independiente de la actividad fagocítica y para la cuantificación de la salida de leucocitos fisiológica (cuando está juntado con citometría de flujo) en el ausencia o presencia de desafío. Ratones de Kaede-Tg constitutivamente expresan una proteína aislada de corales pétreos que exhibe fluorescencia verde (Kaede verde) hasta que se expone a la luz violeta, después de lo cual convierte irreversiblemente a fluorescencia roja (Kaede rojo)33. Las células Photoconverted pueden ser rastreadas como que salida de sitios de tejido periférico y se acumulan en dLNs. Esto y otros similares photoconvertible ratón modelos34,35 han revelado importante biología incluyendo salida constitutiva de las células T reguladoras de piel36, salida de la célula de B de CXCR4-dependiente de placas de Peyer37 , movilización de las células T de memoria residente péptido nuevo reto38y salida amplia del leucocito de tumor microambientes39. En este documento, realizamos una comparación directa de photoconversion con aplicación de FITC transdérmica en el contexto de la inflamación cutánea e infección para permitir la comparación directa de los datos existentes con el método photoconvertible. Además, demostrar photoconversion en tumores implantados y describir la eficiencia de conversión y salida selectiva de microambientes de tumor. Por lo tanto, sostenemos que más aplicación de estos métodos es necesario dilucidar la biología fundamental de salida de leucocitos de tumores, que tendrá implicaciones significativas para interpretar la complejidad del leucocito de intratumoral, inmunidad antitumoral y respuesta a la terapia.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz Silver-LED-405B con fibra óptica y colomor</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Isómero de isotiocianato de fluoresceína I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>ftalato de dibutilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de calibre 29</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 filtros de células mmm</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Caisson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua reparable</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Antiratón purificado CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (clon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clon M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (clon 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (clon 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (clon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (clon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (clon HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (clon 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (clon M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (clon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (clon RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (Fracción V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de partículas de compensación de compensación de control negativo y anti-ratas y antihámster</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Salida de leucocitos de tejidos periféricos a los ganglios linfáticos drenantes no sólo es fundamental para la vigilancia inmune e iniciación sino también contribuye a la resolución de las respuestas del tejido periférico. Mientras que una variedad de métodos se utilizan para cuantificar la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periféricos, los mecanismos celulares y moleculares que rigen la salida dependiente del contexto siguen siendo mal entendidos. Aquí, describimos el uso de photoconversion en situ para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos de piel murina y tumores. Photoconversion permite la directa etiquetado de leucocitos residente dentro del tejido cutáneo. Aunque la exposición a luz ultravioleta induce local las respuestas inflamatorias caracterizan por infiltrados de leucocitos y filtración vascular, en una comparación directa con aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, photoconversion específicamente etiquetado las poblaciones migratorias dendrítico de la célula y al mismo tiempo permitió la cuantificación de salida mieloide y linfoide de microambientes cutáneas y tumores. Los mecanismos de salida de leucocitos siguen siendo un componente faltante en nuestra comprensión de la complejidad de leucocito intratumoral, y así la aplicación de las herramientas descritas en este documento proporcionará una visión única en la dinámica de tumor inmunes microambientes ambos en constante estado y en respuesta a la terapia.

Primero intentamos replicar los resultados photoconversion publicados en la literatura para evaluar la eficacia y determinar la inflamación asociada en la piel de ratón. El pabellón de la oreja fue expuesto a la luz 100 de mW violeta (405 nm) para 3 minutos como se ha descrito33. Solo suspensiones celulares generados a partir de la piel del oído o dLNs cervical inmediatamente después de la exposición revelaron una eficiencia de conversión del 78% de CD45 todos...

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

La fotoconversión proporciona un método in vivo rastreable para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos para una visión mecanicista de la residencia de leucocitos y la dinámica de salida de múltiples sitios de tejido en estados enfermos. Bueno, aquí demostramos la utilidad del seguimiento de leucocitos de tumores cutáneos. La aplicación de este ensayo a otros tejidos y enfermedades está limitada sólo por la capacidad de administrar la luz.La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación de poblaciones endógenas, en lugar de células inmunitarias transferidas como una salida de tejidos inflamados in vivo. Para inducir la inflamación, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, utilice una micropipeta para administrar 20 microlitros de ftalato de dibutilo o DBP, en el lado ventral del pinna del oído de un ratón transgénico Kaede anestesiado. Después de permitir que el DBP se seque, tire de la oreja a través de una hendidura en un pedazo de papel de aluminio y utilice cinta adhesiva de doble cara para fijar la oreja planamente a la lámina con el lado dorsal hacia arriba.A continuación, coloque que está directamente debajo de una fuente de luz de 405 nanómetros y fotoconvierta durante tres minutos a 100 milivatios de potencia. Para la infección por vacunas, utilice una micropipeta para administrar 5 veces 10 a la 6a placa que forma unidades del virus de la vacuna en 10 microlitros de PBS en el pinna del oído de un ratón transgénico Kaede anestesiado y pinche el pinna 25 veces. 24 horas más tarde, photoconvertir el pinna como se acaba de demostrar.En el punto de tiempo experimental apropiado, cosecha las pinnas y los ganglios linfáticos cervicales e inguinales y usa dos pares de pinzas para despegar el lado ventral y dorsal de cada pinna. A continuación, coloque los ganglios linfáticos y las piezas de pinna, con el interior de la oreja hacia abajo, en pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene 1 miligramo por mililitro de colágeno D y 80 unidades por mililitro de dnasa diluida en HBSS que contiene calcio y magnesio. Utilice dos agujas de calibre 29 para abrir cada cápsula del ganglio linfático y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Al final de la incubación, presione los tejidos de pinna y ganglios linfáticos digeridos a través de coladores separados de células de nylon de 70 micras para obtener suspensiones de una sola célula de cada tejido. Cuando los tumores hayan crecido al tamaño experimental adecuado, afeite cualquier piel recién regenerada alrededor del sitio del tumor y tire del tumor a través de un agujero circular cortado en un pedazo de papel de aluminio. Coloque el tumor directamente debajo de la fuente de luz de 405 nanómetros y fotoconvertir durante 5 minutos a 200 milivatios de potencia.24 horas después de la fotoconversión, cosecha los tumores y ganglios linfáticos braquiales e inguinales de cada animal y usa tijeras para picar los tumores dentro de pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene Colágenoasa D y DNase en HBSS. Coloque los ganglios linfáticos en pozos separados y haga una burla para abrir las cápsulas como se acaba de demostrar. Después de incubar los tumores durante una hora y los ganglios linfáticos durante media hora a 37 grados Celsius, presione los tejidos digeridos a través de coladores separados de 70 micras para obtener suspensiones de una sola célula de cada tejido.Para analizar las suspensiones de una sola célula por citometría de flujo, primero recoja el bazo o la sangre de un ratón transgénico Kaede y lyse los glóbulos rojos con tampón de potasio de cloruro de amonio. Divida las células en un Kaede FITC no convertido y una población de Kaede PE convertida y resuspendir las células Kaede PE de un solo color en un mililitro de PBS en un pozo de una placa de 24 pozos, luego fotoconvertir las células durante 5 minutos bajo una fuente de luz de 405 nanómetros a 100 milivatios de potencia. A continuación, utilice las celdas Kaede PE fotoconvertidas y las células Kaede FITC no convertidas para establecer los voltajes fotomultiplicadores en 70 a 80% del rango total de cada canal fluorescente.Una vez que se hayan establecido los voltajes para las proteínas Kaede, compense todas las demás manchas de anticuerpos primarios utilizando cuentas de compensación etiquetadas con un solo fluoróforo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, ejecute las muestras en el citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar. Las suspensiones de una sola célula generadas a partir de la piel del oído o de los ganglios linfáticos drenantes cervicales inmediatamente después de la exposición a la fotoconversión revelan una eficiencia de conversión del 78% de todos los leucocitos positivos CD45 en la piel, sin que se observen células convertidas en los ganglios linfáticos drenantes.La cuantificación del número de leucocitos positivos CD45 infiltrados en oídos fotoconvertidos cero y 24 horas después de la conversión, revela que la exposición a la luz violeta provoca un aumento estadísticamente significativo en la infiltración de leucocitos. Este aumento en la infiltración positiva de leucocitos CD45 sin embargo, es pequeño en relación con la infiltración inducida por un potente estímulo inflamatorio como el virus de la vacuna. La fotoconversión también aumenta la permeabilidad vascular en las pinnas del oído medida por el ensayo Miles, lo que en conjunto indica que se deben tener en cuenta los efectos de la luz violeta en la inflamación del tejido al optimizar la dosis, el tiempo de exposición y la interpretación de los datos.El análisis citométrico de flujo de células tumorales disociadas de animales fotoconvertidos revela una conversión significativa de células positivas CD45 intratumorales de Kaede FITC positivas a Kaede PE positivas, mientras que las células de los ganglios linfáticos drenan permanecen sin convertir. La eficiencia de la fotoconversión de los leucocitos positivos CD45 varió significativamente entre los tipos y tamaños de tumores, con leucocitos positivos CD45 dentro de pequeños tumores de melanoma que demuestran la fotoconversión más eficiente. A medida que aumentan los volúmenes tumorales, la eficiencia de conversión disminuye a alrededor del 50%Notablemente, la melanina tiene un impacto sorprendente en la eficiencia de la fotoconversión con una máxima fotoconversión de células positivas CD45 observadas dentro de tumores productores de melanina de sólo alrededor del 30% en tumores más pequeños, que cae al 10% a medida que los volúmenes tumorales se acercan a 400 milímetros cúbicos.El examen de los ganglios linfáticos drenantes tumorales 24 horas después de la fotoconversión revela la presencia de células inmunitarias positivas rojas Kaede de varios fenotipos, lo que demuestra la emigración de leucocitos del tumor fotoconvertido. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Inmunología descubrieran la cinética del estado estacionario y la rotación de leucocitos inflamada en el tejido periférico. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que sólo el tejido de interés es fotoconvertido, ya que la fotoconversión involuntaria del tejido circundante comprometerá sus resultados.Los individuos nuevos en este método deben optimizar el tiempo de exposición para la conversión de su tejido, así como la duración de los tiempos antes de que se produzca la recolección de tejido en función de la dinámica del leucocitos de interés.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

Este video muestra un ensayo para monitorear la migración de células dendríticas después de una infección por Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG en ratones. Tras la infección bacteriana, las células DC de la piel activadas se marcan con un colorante de éster succinimidilo (CFSE) de diacetato de carboxifluoresceína permeable a las células. Después de un intervalo adecuado para la migración de DC al ganglio linfático de drenaje poplíteo, las células ganglionares se aíslan y se...

Ensayo basado en CFSE para controlar la migración de células dendríticas de la piel a los ganglios linfáticos drenantes en ratones infectados

Este protocolo describe un método para la evaluación detallada de subconjuntos de leucocitos dentro del microambiente tumoral en un modelo tumoral de ratón. Las células de melanoma B16 que expresan quimerina se implantaron por vía subcutánea en ratones singénicos. A continuación, las células del microambiente tumoral se tiñeron y analizaron mediante citometría de flujo, lo que permitió realizar análisis detallados de subconjuntos de leucocitos.

Evaluación de tumor infiltrante de leucocitos subconjuntos en un modelo de tumor subcutáneo

Se describe un ensayo en ratones para rastrear la migración celular de la piel al ganglio linfático drenante que permite la caracterización de las células dendríticas de la piel movilizadas al ganglio linfático después de la infección de la almohadilla del pie con Bacille Calmette-Guérin.

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Aprende a cuantificar la salida de leucocitos desde tumores cutáneos en ratones transgénicos Kaede mediante fotoconversión in vivo. Este método permite rastrear poblaciones endógenas de células inmunes y analizar su dinámica mediante citometría de flujo.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

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