Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8⁺ específicas de tumores

Este ensayo se puede emplear para cuantificar simultáneamente la citotoxicidad mediada por células T contra dos epítopos peptídicos distintos de antígenos tumorales. La naturaleza in vivo de este ensayo permite medir la función citotóxica de las células T dentro de la arquitectura intacta de un órgano linfoide secundario. Además, la matanza observada es un reflejo preciso del número absoluto de células T, y no sólo sus frecuencias, lo que puede ser engañoso.

Este ensayo permite el examen de las respuestas de los linfocitos T citotóxicos a antígenos tumorales inmunodominantes y subminantes. Por lo tanto, proporciona información valiosa cuando se diseña una vacuna, así como protocolos inmunoterapéuticos para el cáncer. Nuestro protocolo ha sido diseñado para estudiar las respuestas de los células T CD8.

Sin embargo, se puede modificar para medir la citotoxicidad provocada por otros tipos de células asesinas, como las células NK y los linfocitos T de forma innata. Este ensayo requiere experiencia en técnica aséptica, manejo de tejido de ratón, preparación de células diana, así como experiencia en inyecciones de venas de cola. Uno necesita adquirir este conjunto de habilidades antes de intentar el ensayo de asesinato in vivo.

Una vez que la línea celular tumoral adherente del antígeno T se haya vuelto totalmente confluente o ligeramente sobrefluente, enjuague suavemente la monocapa con PBS estéril y caliente, y desprenda las células tumorales con 0.25%trypsin EDTA en un gabinete de bioseguridad. Toque los lados del matraz de cultivo varias veces para liberar las células adherentes restantes y detenga la reacción después de unos cinco minutos con la adición de cinco mililitros de medio DMEM. Pipetear la solución celular unas cuantas veces antes de filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros-poro en un tubo cónico de 50 mililitros.

Recoger las células por centrifugación, y resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS estéril, frío para el primero de tres lavados en las mismas condiciones. Después del tercer lavado, resuspender las células a cuatro veces 10 a las siete células por mililitro de concentración estéril de PBS, e inyectar 500 microlitros de la suspensión de células tumorales T-antígeno positivo intraperitonealmente en cada receptor de ratón C57 Black 6 de seis a 12 semanas de edad. Para la preparación del esplenocito objetivo, coloque el ratón donante eutanizado en la posición propensa y rocíe el animal con 70% de etanol.

Usando fórceps estériles y tijeras, levante la piel y haga una pequeña incisión ventral de la línea media. Corta la piel de una manera cruzada para exponer el peritoneo, y usa los fórceps para levantar el peritoneo de una manera similar a una tienda de campaña, sin atrapar ninguno de los órganos internos. Abra el peritoneo para exponer la cavidad peritoneal y transfiera suavemente el bazo a una trituradora de tejido Dounce de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS estéril.

Utilice el émbolo para aplicar presión manual hasta que el tejido esplénico se disipe en una suspensión celular homogénea roja, y transfiera el homogeneato a un tubo de 15 mililitros. Recoger la suspensión por centrifugación, y resuspender el pellet en cuatro mililitros de cloruro de amonio de cloruro de amonio tampón de lisina de potasio para eliminar los eritrocitos. Después de cuatro minutos, detenga el proceso con ocho mililitros de medio completo y filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros de poro en un nuevo tubo de 50 mililitros.

Separe los glóbulos blancos de los restos de glóbulos rojos por centrifugación, y resuspendir el pellet en 12 mililitros de medio completo. A continuación, divida la suspensión del esplenocito en tres alícuotas de cuatro mililitros iguales. Para la codificación de péptidos de los splenocitos diana, pulse una alícuota de esplenocito con un micromolar de péptido irrelevante, una alícuota con un micromolar del péptido del sitio I y una alícuota con un micromolar del péptido del sitio IV durante una hora a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono.

Al final de la incubación, retire el exceso de péptido por centrifugación y lave los esplocitos pulsados por péptidos dos veces en 12 mililitros de PBS estéril y frío por lavado por tubo. Después del segundo lavado, resuspender las células en cuatro mililitros de PBS fresco y estéril por tubo. Agregue 025, 0.25 y CFSE de dos micromolares a las suspensiones de esplenocitos con pulsos de péptidos irrelevantes, del sitio I y del sitio IV, respectivamente.

Coloque los tubos a 37 grados centígrados durante 15 minutos con inversión manual una vez cada cinco minutos. Al final de la incubación, añadir tres mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor a cada tubo para detener la reacción CFSE y llevar el volumen final en cada tubo hasta 15 mililitros con PBS. Luego recoge las células etiquetadas con tinte por centrifugación para dos lavados en 12 mililitros de PBS fresco y estéril por lavado.

Para confirmar un etiquetado CFSE adecuado de los esplenocitos diana, resuspendir el pellet en tres mililitros de PBS y mezclar con vórtices suaves. Transfiera 10 microlitros de cada suspensión celular etiquetada con CFSE a una clasificación individual de células de poliestireno inferior redondo de cinco mililitros, o tubo FACS, que contiene PBS, y cargue el tubo en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nanómetros. En el software del citometro de flujo, cree una puerta de linfocitos basada en las propiedades de dispersión hacia adelante y dispersión lateral de las células antes de adquirir 5.000 eventos que caen dentro de la puerta de linfocitos en el canal Fluorescencia 1.

Dentro de la población cfSE-positiva principal, dibuje puertas de histograma adicionales para identificar las subpoblaciones CFSE-bajas, CFSE-intermedias y CFSE-high. A continuación, confirme un número de evento igual o casi igual dentro de las tres puertas para los otros dos tubos de las células etiquetadas. Para la inyección de las células diana, primero vórtice suavemente los tubos de origen y acote las tres suspensiones de células etiquetadas con CFSE en un nuevo tubo con las mismas proporciones.

Rebanar el contenido del tubo con PBS estéril, y recoger las células por centrifugación para el conteo. Luego ajuste el volumen a una vez 10 a las siete células diana mixtas por cada 200 microlitros de PBS por concentración de receptor, e inyecte 200 volúmenes de microlitro de la suspensión celular en la vena de la cola de cada receptor C57 Black 6 ratón. Dos o cuatro horas después de la inyección, retire y procese el bazo de cada animal receptor como se ha demostrado, y resuspendir los glóbulos blancos aislados en tres mililitros de PBS por bazo.

Transfiera aproximadamente una vez 10 a las siete células de cada bazo procesado en un tubo FACS limpio, e inmediatamente ejecute las células en el citómetro de flujo como se demostró para gatear las poblaciones de células de destino bajo, intermedio y alto CFSE. A continuación, adquiera un total de 2.000 eventos cfSE-bajos en el canal Fluorescence 1, y calcule la lysis específica de cada población de células diana cognada de acuerdo con la fórmula detallada en el texto. En este experimento representativo, el éxito del agotamiento de las células T reguladoras de origen natural en ratones inyectados con anticuerpos monoclonales anti-CD25 fue confirmado por citometría de flujo.

Como era de esperar, los picos casi iguales correspondientes a las células diana de control y cognados eran detectables en ratones ingenuos. Por el contrario, las células diana que mostraban el sitio IV estaban casi completamente ausentes en ratones con T-antígeno-cebado, independientemente de su tratamiento previo con anticuerpos monoclonales anti-CD25 o PBS. Curiosamente, el agotamiento natural de las células T reg por anticuerpos monoclonales anti-CD25 aumenta la lysis mediada por linfocitos T citotóxicas in vivo de las células diana pulsadas por el sitio I.

En esta segunda investigación representativa, el bloqueo programado de la muerte 1 mejoró los sitios de células T subminiopositivas CD8 positivos, una y dos respuestas específicas de dos cortes de tres, lo que sugiere que interferir con las interacciones programadas del ligando de muerte 1/ligando de muerte programada 1 puede inducir la propagación del epítopo en las respuestas de células T cd8-positivas contra el cáncer. Es fundamental cuando etiquete las células de su donante con CFSE, asegúrese de que sus concentraciones sean precisas. De lo contrario, esto puede dar lugar a picos de histograma superpuestos, lo que dificulta los cálculos necesarios y la interpretación de datos, si no imposible.

Será importante optimizar los ensayos de citotoxicidad in vivo para cuantificar las funciones de efector provocadas por diferentes tipos de células asesinas que reconocen antígenos péptidos y no peptídicos en el mismo huésped.