In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed ^(TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios morfológicos in vivo.

Nuestro protocolo nos permite visualizar cómo las células etiquetadas fluorescentemente responden a un estímulo periférico inflamatorio en un animal vivo en tiempo real. Las imágenes de 2 fotones permiten la visualización profunda en el tejido de una muestra viva, preservando la integridad de sus células y su microambiente y proporcionando una representación precisa del sistema biológico. Respirar mueve la pata con el tiempo, causando borrosidad y una pérdida del plano focal.

Asegúrese de colocar la pata firmemente con cinta adhesiva en una superficie estable antes de tomar imágenes. En esto usted debe ser capaz de encontrar el plano de interés adecuado, asegúrese de que el objetivo está cerca de la pata sin tocar y está directamente por encima del sitio de inyección. Antes de comenzar el procedimiento, encienda el sistema multi-fotones y seleccione el subjetivo 25X.

Coloque un aparato estereotaxico en el escenario del microscopio multitónico y conecte el aparato a una máquina de administración de anestesia. Coloque un pedazo de papel negro mate sobre la superficie del aparato como punto de conexión para la pata del ratón. Ajuste el escáner de resonancia con un área de escaneo fija de 512 por 512 micrómetros.

Ajuste los láseres de excitación a las longitudes de onda de excitación de 930 y 1, 100 nanómetros para señales de proteína fluorescente verde y roja respectivamente. Utilice un espejo dicroico de 690 a 1.050 nanómetros para dirigir la trayectoria de luz de ambos láseres de excitación al objetivo único, lo que permite que el láser de excitación sintonizado de 930 nanómetros se refleje en el escáner principal y el láser de 100 nanómetros sintonizado pase directamente al escáner principal. A continuación, ajuste la potencia láser de FITC al 5% y la proteína fluorescente verde al 20% y apague las luces aéreas.

Para imágenes in vivo, anestesar el ratón y esbozar en el protocolo de texto. Confirme la falta de respuesta al pellizco en el ratón anestesiado y coloque el ratón en el aparato estereotaxio con acceso a un cono nasal. Utilice cinta negra para fijar firmemente la pata trasera a la pieza de papel negro en áreas tanto proximales como distales en el área de interés, asegurándose de que la superficie plantar de la pata esté sin obstrucciones y mirando hacia arriba hacia el objetivo.

Coloque una cantidad generosa de lubricante a base de agua sobre la superficie plantar de la pata. Toque el objetivo al lubricante para crear una columna de líquido entre la pata y el objetivo. Utilice la luz de excitación FITC para enfocarse en la capa dérmica de la pata, confirmando que se pueden visualizar los fibroblastos etiquetados con dimer tándem Tomate.

Imagen del área de celdas situada justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con ambos láseres. Adquiera un lapso de tiempo de 15 minutos de aproximadamente cinco a 10 rodajas Z a aproximadamente un micrómetro por rebanada para establecer una representación de línea de base del entorno. Cuando se haya obtenido la imagen basal, cargue una jeringa Hamilton de vidrio de 25 microlitros con cinco microgramos de lipopolisacárido conjugado FITC, o LPS, por cada 20 microlitros de PBS.

Administrar la solución mediante inyección intraplantar en la pata trasera experimental sin alterar la posición de la pata. A continuación, imagine un área de celdas situada justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con ambos láseres. Adquiera un lapso de tiempo de 60 a 120 minutos de aproximadamente cinco a 10 rodajas Z a aproximadamente un micrómetro por rebanada para identificar la captación intraplantar mediada por célula de LPS FITC.

Como no hay fluorescencia inherente por las células dentro de la capa dérmica, una miríada de células en la capa dérmica de la pata trasera se puede observar tomando LPS etiquetada fluorescentemente después de la inyección intraplantar en un ratón de tipo comodín. Después de la inyección de LPS FITC, sólo fibroblastos de proteína específica de fibroblastos un fibroblastos positivos que expresan peaje como receptor cuatro se unen y captan la proteína inyectada con un alto nivel de co-localización con una etiqueta de tomate dimer en tándem expresada por estas células. Por el contrario, los ratones que tienen peaje como receptor cuatro noqueados fuera de todo el cuerpo no se unen y captan LPS después de la inyección.

De hecho, las siluetas celulares son visibles después de la inyección de LPS FITC que indica que el fármaco se está dispersando en el líquido intersticial alrededor de las células, pero en realidad no está siendo unido por un receptor. Lo más importante a recordar en este protocolo es asegurarse de que la pata está inmovilizada para que no haya distorsiones en el video debido al movimiento o la respiración. Mediante este procedimiento, se puede realizar un seguimiento del reclutamiento de células etiquetadas fluorescentemente en un área después de una lesión y los cambios morfológicos en la respuesta de una célula a un estímulo a lo largo del tiempo.

Así que las imágenes de 2-Photon permiten a los investigadores combinar ratones reporteros genéticos y compuestos con etiquetas fluorescentes para evaluar lo que sucede en un animal vivo después de una inyección.