Name: Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a cultivar neuronas cerebelosas primarias de ratón embrionario para estudiar desarrollo neuronal in vitro. Este protocolo permite analizar morfología, axones y dendritas de neuronas de Purkinje.

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Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), y Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant n.o 320035), y la ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).

Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales y ha sido aprobado por las autoridades locales ("el Bannatyne Campus Animal Care Comité"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número y el sufrimiento de los animales utilizados. La profundidad adecuada de la anestesia se confirmó observando que no hubo ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación y pellizcar los dedos del dedo del dedo del dedo del tiempo o el reflejo corneal.
1. Preparación
NOTA: Programar la provisión de ratones embarazadas cronometradas, basada en el plan de investigación, para E12–E18 post-concepción. La elección de la sincronización depende de las características de celda deseadas (ver más abajo). Prepare los resbalones y las placas de la cubierta al menos 2 días antes del experimento. La poli-L-ornitina se utiliza como material de recubrimiento para mejorar la fijación celular a los resbalones de la cubierta.
<ol><li>Recubrir la cubierta se desliza 2 días antes del aislamiento celular.<ol>
<li>Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pocillos, en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Deje un hueco entre cada resbalón de la cubierta para evitar cualquier contaminación.</li>
<li>Añadir 90 l de poli-l-ornitina (PLO, 500 g/ml) al centro de cada resbalón de la cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en una incubadora de CO2 de 37oC/5% durante 2 días. NOTA: Un mayor volumen puede derramarse los resbalones de la cubierta durante la incubación. El resbalón de la cubierta no necesita ser completamente cubierto con PLO después de colocar una gota. Durante la incubación durante la noche, la OLP se distribuye por igual al borde de los resbalones de la cubierta.</li>
</ol>
</li>
<li>Un día antes del aislamiento celular, preparar el medio de cultivo I (DMEM/F-12 que contiene putrescina 100 m, selenita sódica 30 nM, L-glutamina 3,9 mM, gentamicina 3,5 g/mL, tridotironina (T3) 0,5 ng/ml, y suplementos de N3 [progésima 4M, insulina 20g/mL, transferrina 20 mg/ml]) y medio de sembrado (medio de cultivo I [sin N3 y T3] que contenga un 10% de suero bovino fetal [FBS]) y guárdelos en 4oC. Preparar la solución de trabajo de tripsina (0,25%) en DMEM/F12 y mantenerlo a 4oC. NOTA: Las composiciones medianas se proporcionan en el Cuadro 1.</li>
<li>El día del aislamiento celular, coloque el cultivo medio I y el medio de sembración en la incubadora a 37oC. NOTA: Antes de iniciar el aislamiento del cerebelo, asegúrese de que todas las herramientas y superficies de trabajo estén estériles.</li>
<li>Lave los resbalones de la cubierta.<ol>
<li>Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.</li>
<li>Lave los resbalones de la cubierta en la placa de 24 pocillos 3x con agua destilada doble (DDW) en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Cada vez que la cubierta se resbale empape en DDW durante 5 minutos antes de iniciar la aspiración.</li>
<li>Deje los resbalones de la cubierta en un armario de bioseguridad durante al menos 2 h para secarpor por completo.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. Colección cerebelo
<ol><li>Preparar tres platos Petri de plástico estéril de 10 cm llenos de solución salina con 1fosfato helado (PBS), 3 platos petri llenos de solución salina equilibrada de Hank 1x en frío y aproximadamente 5 platos de Petri llenos de medio de disección helada (1x HBSS) que contiene gentamicina 10 g/ml). Mantenlos en hielo.</li>
<li>Anestetizar el ratón embarazada E18 CD1 con 40% de isoflurano. Realice la luxación cervical en el ratón. Esterilice el abdomen con un 70% de solución de etanol.</li>
<li>Usa un par de tijeras para hacer una incisión cutánea desde la sínfisis púbica hasta el proceso de xifoidea. Luego sostenga la piel con fórceps y abra la cavidad abdominal.</li>
<li>Excise los cuernos uterinos con fórceps y lávalos 3 veces en el frío helado 1x PBS sobre hielo. NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en hielo para minimizar la tasa metabólica y prevenir el daño de tejidos y células.</li>
</ol>3. Disecting the cerebellum
<ol><li>Después del último paso de lavado, el uso de un par de fórceps finos separa los embriones del útero en 1x HBSS y transfiéralos al medio de disección helada. En el medio de disección, decapitar los embriones con tijeras. Coloque el tejido en un medio de disección limpio. NOTA: El uso de un estereomicroscopio para microdisección es opcional.</li>
<li>Sostenga el cráneo con fórceps finos y corte a través del calvario con un par de tijeras pequeñas desde el aspecto lateral del cráneo en una línea desde el foramen magnum hasta el borde acústico externo y inferior de la cavidad orbital. NOTA: Tomar este paso expone la cavidad craneal a nivel de la base del cráneo y facilita la extirpación del cerebro.</li>
<li>Usando un par de fórceps finos, extrae la base del cráneo y despega el cráneo del cerebro.</li>
<li>Retire cuidadosamente las meninges en el cerebelo, comenzando desde la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebelosos medios.</li>
<li>Cortar ambos pedúnculos cerebelosos y separar el cerebelo del resto del cerebro (Figura 1).</li>
<li>Colocar inmediatamente la cerebelosa recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de 14 ml de DMEM/F12 sobre hielo.</li>
<li>Centrifugar el tubo a 1.000 x g,4oC durante 1 min, 3x. Cada vez retire suavemente el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco y helado. NOTA: Para evitar la pérdida de las muestras, utilice la succión del gabinete lo menos posible.</li>
</ol>4. Disociación del cerebelo
<ol><li>Añadir 2 ml de trippsina precalentada (37 oC) al pellet del paso 3.7 y pipetear suavemente para una mezcla adecuada.</li>
<li>Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 12 minutos.</li>
<li>Después de la incubación, llevar el tubo a un gabinete de bioseguridad y añadir 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la trippsina.</li>
<li>Centrifugar la mezcla a 1.200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco. Repita 3x.</li>
<li>Premoje un pipeta de transferencia de plástico estéril con DMEM/F12.</li>
<li>Después del lavado y la centrifugación final, añadir 3,5 ml de solución de trabajo DNase (1 ml de solución de stock DNase I [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] en 500 ml de FBS inactivado por calor y 2 ml de DMEM/F12) al pellet en el mismo tubo.</li>
<li>Triturar el tejido con un pipeta de al menos 30 veces hasta que la mezcla alcance un color lechoso homogéneo.</li>
</ol>5. Colección de células
<ol><li>Añadir 10 ml de DMEM/F12 helado a la mezcla.</li>
<li>Centrifugar la muestra a 1.200 x g,4 oC durante 5 min.</li>
<li>Retire con cuidado el sobrenadante sin molestar el pellet.</li>
<li>Retire el medio de semilla de la incubadora.</li>
<li>Añadir 500 l de medio de semilla precalentado al pellet y mezclarlo muy bien usando un pipeta para resuspender las células.</li>
<li>Cuente las células usando un hemocaquímetro.</li>
<li>Diluir la suspensión celular con el medio de sembración a una densidad de 5 x 105 células/ml.</li>
<li>Debajo de un armario de bioseguridad, agregue 90 ml de la mezcla diluida a cada pocto en el centro del resbalón de la cubierta. NOTA: No cargue las partículas que no se suspendieron en el DNase.</li>
<li>Colocar la placa en la incubadora a 37oC durante 3x4 h.</li>
<li>Después de la incubación, añadir 500 l de medio de cultivo precalentado I a cada poca y volver a colocar la placa en la incubadora (37 oC).</li>
</ol>6. Tratamiento de las células recuperadas
<ol><li>Después de 7 días, sustituya el medio antiguo por un medio de cultivo fresco II (medio de cultivo que complementé con aleósido de citosina [Ara-C, 4 m] y albúmina sérica bovina de 100 g/ml [BSA]; véase el cuadro 1). NOTA: Este paso es fundamental para evitar el crecimiento de células no neuronales.</li>
<li>Supervise el medio de cultivo una vez al día. Si el pH cambia (indicado por un marcado cambio de color, generalmente más amarillento), retire la mitad (casi 250 ol) del medio antiguo de todos los pozos y agregue 300 s de medio de cultivo precalentado I a cada uno de ellos para evitar la pérdida de nutrientes. NOTA: El rojo fenol en el medio de cultivo es un buen indicador del pH del medio y la actividad de las células. Trate de minimizar el tiempo de exposición de las células a las condiciones de incubadora. Esto evita cualquier estrés que pueda afectar a su viabilidad.</li>
</ol>7. Recogida y fijación de celdas
NOTA: Dependiendo del diseño experimental, las células se pueden recoger en cualquier día, en cualquier momento.
<ol><li>Preparar una placa separada de 24 pocillos con la organización numérica correspondiente y añadir 100 s de 4% de paraformaldehído (PFA) a cada pocal.</li>
<li>Para cosechar las células en los días deseados (dependiendo del protocolo experimental), retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pocillos de la placa de cultivo original y colóquelas en los pocillos correspondientes de la placa llena de PFA.</li>
<li>Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta. NOTA: Para evitar el desprendimiento de la celda del resbalón de la cubierta, no agregue el PFA directamente en el resbalón de la cubierta.</li>
<li>Mantenga la placa PFA a 4oC durante 30 o 120 min.</li>
<li>Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente.</li>
<li>Lave suavemente los resbalones de la cubierta 3 veces durante 5 min con 1PBS.</li>
<li>Proceda al proceso de inmunomancha. NOTA: En este estudio, se utilizó un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara para capturar las imágenes y ensamblado en montajes utilizando una aplicación de software de edición de imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiffard%2C+RG+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384(2017).</li>
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<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Check+your+cultures%21+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li>
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<li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+a+breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
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<li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li>
<li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li>
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<li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li>
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<li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li>
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<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634(2012).</li>
<li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thimerosal+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de cultivos primarios es un método bien conocido aplicable a todos los tipos de neuronas17,18,19. En el protocolo presentado, explicamos cómo aislar las neuronas cerebelosas y mantener su viabilidad con una supervivencia óptima in vitro durante un máximo de 3 semanas. El cultivo primario de células cerebelosas, que fueron aisladas en E15-E18, confirma la recolección de tres clases de neuronas grandes: PCs, células Golgi y...

Durante varias décadas, las líneas celulares se han utilizado ampliamente como una herramienta de alto rendimiento en estudios preclínicos e investigaciones biológicas. Coste-efectividad, crecimiento rápido, y la reducción del uso de animales vivos son algunos beneficios del uso de estas células. Sin embargo, las alteraciones genéticas y los cambios fenotípicos se acumulan después de varios pasajes in vitro1. La identificación errónea de las líneas celulares y la disparidad genética de las células primarias pueden dar lugar a experimentos irreproducibles y conclusiones falsas2,3,4,5. Por lo tanto, a pesar de algunas similitudes con las células diferenciadas como las neuronas (por ejemplo, neurotransmisores, canales iónicos, receptores y otras proteínas específicas de las neuronas), las líneas celulares neuronales no pueden replicar el fenotipo completo de las neuronas. El uso de neuronas maduras es otra opción; sin embargo, estas células son células postmitoticas no divisorias que son difíciles de propagar en el cultivo. Además, el reingreso en el ciclo celular puede precipitar la apoptosis6.
El cultivo celular tridimensional (3D), los cultivos de rebanadas organotípicas y los cultivos organoides se han desarrollado para proporcionar un entorno en el que las células pueden organizarse en una forma 3D que imita el entorno in vivo. Por lo tanto, la comunicación de célula a célula, la migración, la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes, y la angiogénesis se pueden estudiar7. Sin embargo, los costos adicionales de usar proteínas de matriz celular adicional (ECM) o hidrogeles sintéticos como ropa de cama, dificultad en la toma de imágenes y compatibilidad con instrumentos de cribado de alto rendimiento son inconvenientes considerables del cultivo de células 3D. Una desventaja importante del cultivo de rebanadas de tejido organotípico es el uso de un gran número de animales y los efectos adversos de la axotomía, que conduce a la inaccesibilidad de las dianas y factores de crecimiento de los axones, y en consecuencia la muerte neuronal8.
Por lo tanto, un enfoque alternativo, que evita los problemas con las líneas celulares, la dificultad del crecimiento de las células maduras y la complejidad de los tejidos, es la maduración in vitro de células primarias inmaduras. Las células primarias se derivan directamente del tejido humano o animal y se disocian utilizando métodos enzimáticos y/o mecánicos9. Los principios principales de aislamiento, sembrado y mantenimiento en el medio de cultivo son similares independientemente de la fuente de tejido. Sin embargo, los factores tróficos necesarios para promover la proliferación y la maduración son altamente específicos de las células6.
Conocer la "fecha de nacimiento" de cada tipo de célula cerebelosa es un requisito previo para diseñar un experimento de cultivo primario. En general, las células purkinje (PC) y las neuronas de los núcleos cerebelosos (CN), nacen antes que las células más pequeñas, incluidas las interneuronas (por ejemplo, cesta, células estelares) y las células del gránulo. En ratones, los PC emergen entre el día embrionario (E)10–E13, mientras que las neuronas CN aproximadamente E9–E1210.
Otras neuronas cerebelosas nacen mucho más tarde. Por ejemplo, en ratones, la subpoblación Golgi de interneuronas se genera a partir de VZ a (E14-E18) y las interneuronas restantes (célulade cesta y células estelares) ubicadas en la capa molecular emergen de células progenitoras divisorias en la materia blanca entre los primeros postnatal (P)0–P711. Las células de gránulos se generan a partir de la zona germinal externa (EGZ), una zona germinal secundaria que se deriva del labio rombio rostral y pasa por la división terminal después del nacimiento. Pero antes de que sus precursores surjan del labio rombio de E13-E16, las células ya han migrado rostrally a lo largo de la superficie pia para hacer una capa delgada de células en la superficie dorsal del anlage de cerebelo. Las células macrogliales no neuronales como los astrocitos y los oligodendrocitos, que se originan en el neuroepitelio ventricular, nacen en E13.5-P0 y P0-P7 respectivamente11,12,13,14 ,15. Microglia se derivan de las células mieloides mieloides primitivas de yema-sac entre E8–E10 y después de la invasión en el sistema nervioso central se pueden detectar en el cerebro del ratón por E916.
El método presentado en este artículo se basa en el desarrollado originalmente por Furuya et al. y Tabata et al.17,18, que fue optimizado para el cultivo primario de células Purkinje derivadas de Wistar rat cerebella. Ahora hemos adaptado este método y lo hemos modificado cuidadosamente para estudiar el crecimiento de las neuronas cerebelosas de ratón19. A diferencia de nuestro nuevo protocolo, el medio de disección en frío es el principal tampón de lavado utilizado durante los pasos de disección y disociación antes de añadir el medio de sembrado en el protocolo17de Furuya. Este tampón carece de la nutrición, los factores de crecimiento y las hormonas (todo en el medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que son necesarios para apoyar el crecimiento celular y la supervivencia durante los pasos antes mencionados. Además, sobre la base de nuestra amplia experiencia con cultivos cebelosos primarios murinos, hemos utilizado 500 s de medio de cultivo en cada pozo (en lugar de 1 mL) y aumentado la concentración de tri-yodotironina a 0,5 ng/ml, lo que mejora el crecimiento de las células neuronales, en particular aquellos con un fenotipo celular Purkinje, y promueve el crecimiento de las ramas dendríticas en el cultivo. El método principal que aparece en este artículo se puede aplicar ampliamente a otros pequeños roedores (por ejemplo, ardillas y hámsters) durante el desarrollo embrionario y puede utilizarse para estudiar la neurogénesis cerebelosa y la diferenciación en las diversas etapas embrionarias, que difieren entre especies.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Versión 12</td><td>Adobe Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canal antisodio (SCN)PN4 (Nav1.6)</td><td>Sigma</td><td>S0438</td><td>3 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3608</td><td></td></tr><tr><td>CALB1</td><td>Swant Swiss Antibodies (policlonal)</td><td>CB38</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>dilución CALB1</td><td>Swant Swiss Antibodies (monoclonales)</td><td>300</td><td>1/1000 dilución</td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranósido o Arabinósido de citosina (Ara-C)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I de bovino páncreas</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de vendaje</td><td>Delasco</td><td>DF-45</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM-F12)</td><td>Lonza</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos Fisherbrand: Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulina de páncreas bovino</td><td>Millipore sigma</td><td>I5500, I6634, I1882 e I4011</td><td></td></tr><tr><td>Tijera grande</td><td>Stoelting</td><td>52134-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro metalizado</td><td>Hausser Bright-Line</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Microdisección Pinza</td><td>Merlan</td><td>624734</td><td></td></tr><tr><td>Patrón 5 Pinza</td><td>Dixon</td><td>291-9454</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-26</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornitina</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4638</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron (P4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>PVALB</td><td>Swant Swiss Antibodies</td><td>235</td><td>Dilución 1/1500</td></tr><tr><td>Tijera Samll</td><td>WPI Tijeras suizas, 9cm</td><td>504519</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de Sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tri-yodotironina (T3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Microscopio de fluorescencia</td> Generador de imágenes <td></td><td>Zeiss</td><td>Z2</td></tr></tbody></table>

cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

El uso de cultivos celulares primarios se ha convertido en una de las principales herramientas para estudiar el sistema nervioso in vitro. El objetivo final del uso de este sistema de modelos simplificado es proporcionar un microambiente controlado y mantener la alta tasa de supervivencia y las características naturales de las células neuronales y no neuronales disociadas tanto como sea posible en condiciones in vitro. En este artículo, demostramos un método de aislar las neuronas primarias del cerebelo del ratón en desarrollo, colocándolas en un entorno in vitro, estableciendo su crecimiento y monitoreando su viabilidad y diferenciación durante varias semanas. Este método es aplicable a las neuronas embrionarias disociadas del cerebelo entre los días embrionarios 12-18.

Basados en las diferentes fechas de nacimiento de los subtipos neuronales en el cerebelo, los cultivos de embriones de ratón E12-E18 produjeron diferentes tipos de células. Las neuronas de proyección grandes, como las neuronas CN (E9-E12) y los PC (E10-E13), surgieron temprano durante el desarrollo cerebeloso. En ratones, las células de gránulos y Golgi surgieron entre el E13-E18 y se sometieron a divisiones terminales hasta la semana postnatal 4.
La sustitución del medio viejo I por el medio ...

Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

El cultivo celular neuronal primario es un sistema modelo ideal para estudiar las neuronas disociadas en cultivo in vitro. La ventaja de usar este método es ser capaz de mantener las características celulares de las células disociadas, tales como mecanismos, funciones y condiciones in vitro de morfología durante unas semanas lo más cerca posible de la condición in vivo. Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pozos debajo del gabinete de bioseguridad.Agregue 90 microlitros de poli-L-ornitina en cada resbalón de cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 grados durante dos días. Preparar el medio de cultivo y el medio de siembra y mantenerlos a cuatro grados centígrados.Prepare la solución de trippsina de trabajo en DMEM/F12 y manténgala en cuatro grados. Coloque el medio de cultivo y el medio de siembra en la incubadora a 37 grados. Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.Lave los resbalones de la cubierta tres veces con agua doble destilada. Deje los resbalones de la cubierta durante al menos dos horas para secar por completo. Prepare tres platos Petri llenos de PBS frío, tres platos Petri llenos de HBSS frío y cinco platos Petri llenos de medio de disección fría sobre hielo.Exélute los cuernos uterinos y lávelos en PBS frío tres veces sobre hielo. A partir de aquí todos los pasos deben llevarse a cabo sobre hielo para minimizar el daño tisular. Después del último paso de lavado, separe a los cachorros del útero en HBSS y transfieralos al medio de disección en frío.En el medio de disección, decapitar a los cachorros con tijeras. Abra el calvario desde el foramen magnum hasta el borde inferior de la cavidad orbital. Usando un par de fórceps finos, retire la base del cráneo y pele el cráneo del cerebro.Retirar cuidadosamente las meninges del cerebelo a partir de la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebeloso medio. Corta ambos pedúnculos cerebelosos y separa el cerebelo del resto del cerebro. Coloque inmediatamente la cerebella recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de DMEM/F12 sobre hielo.Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados durante un minuto en DMEM/F12. Repita esto tres veces, retirando cada vez suavemente el sobrenadante con una pipeta y re-suspendiendo el pellet en DMEM/F12 fresco. Agregue dos mililitros de trippsina precaleada y pipetee suavemente para mezclarlos.Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados durante 12 minutos. Después de la incubación, lleve el tubo al armario de seguridad y agregue 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la tripina. Centrifugar la mezcla a 1.200 g durante cinco minutos.Desechar el sobrenadante y resuspend en medio fresco seguido de centrifugación tres veces. Pre-mojar una pipeta de plástico estéril con DMEM/F2. Añadir 3,5 mililitros de solución de trabajo DNAse al mismo tubo.Triturar el tejido con una pipeta varias veces hasta que el líquido alcance un color lechoso homogéneo. Añadir 10 ml de DMEM/F12 frío a la mezcla y proceder a la centrífuga. Centrifugar la muestra a 1.200 g a cuatro grados durante cinco minutos.Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Retire el medio de siembra de la incubadora. Agregue 500 microlitros de medio de siembra precalentado y mezcle bien con la pipeta.Cuente las células usando un hemocicómetro. Diluir la suspensión celular con un medio de siembra a una densidad de 500.000 células por mililitro. Añadir 90 microlitros de la mezcla a cada pozo en el centro del cubreobjetos.Coloque la placa en la incubadora a 37 grados durante tres a cuatro horas. Después de la incubación, añadir 500 microlitros de medio de cultivo precalentado en cada pocód en cada pocód en. Sustituya la placa en la incubadora a 37 grados.Después de siete días, sustituya el antiguo medio por medio de cultivo fresco II.Prepare una placa separada de 24 pozos con la organización numérica correspondiente y agregue 100 microlitros de PFA 4% a cada pozo. Después de los días deseados en el cultivo, retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pozos de la placa de cultivo original y colóquelos en los pozos correspondientes de la placa PFA descrita en el paso anterior. Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta.Mantenga la placa PFA a cuatro grados durante 30 a 120 minutos. Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente. Lave suavemente los resbalones de la cubierta con PBS durante cinco minutos tres veces.La figura dos del texto muestra el cultivo de células cerebelosas a partir de E18. La inmunofluorescencia para la calbinadina muestra las neuronas de Purkinje con extensiones axonales por tres días in vitro. Por siete a 10 días in vitro, los procesos dendríticos son evidentes.A los 21 días, las ramas dendríticas complejas están presentes. La figura tres del texto muestra cultivos celulares cerebelosos a partir de varios días embrionarios. la detección de inmunofluorescencia de la calbinada muestra las neuronas purkinje con axones tempranos sólo después de 18 días in vitro.Los cultivos de neurona purkinje comenzaron en E14 y E15 desarrollarán dendritas, pero nunca tan complejas como las que se desarrollan cuando E18 es el punto de partida. La figura cuatro del texto muestra que diferentes tipos de células se desarrollan a partir de cultivos E18 después de 21 días in vitro. La inmunofluorescencia verde de Calbindin muestra las neuronas Purkinje.La inmunofluorescencia roja para la parvalbumina en B y C muestra interneurones inhibitorios. La inmunofluorescencia roja para el canal cerrado por voltaje de sodio en E y F muestra las neuronas de gránulos. El presente protocolo es rentable y fácil de llevar a cabo.Al final de este video, usted será capaz de recoger y cultivar neuronas cerebelosas y arreglarlos en los DIVs deseados.

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Investigación

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Neurociencia

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Este video muestra la técnica para aislar y cultivar neuronas cerebelosas primarias de ratón. Las células se tratan con un antimetabolito para eliminar las células gliales proliferantes y producir un cultivo puro de neuronas granulosas cerebelosas.

Aislamiento y cultivo de neuronas cerebelosas primarias de ratón

Este video muestra el aislamiento y cultivo de células progenitoras neurales cerebelosas del cerebelo de un cachorro de ratón. Los progenitores de las neuronas granulosas cerebelosas se aíslan y purifican a través de la adhesión diferencial, eliminando eficazmente los astrocitos. Estos progenitores cultivados se diferencian posteriormente en neuronas granulosas cerebelosas.

Aislamiento y cultivo de progenitores granulares de neuronas cerebelosas murinas

Este video muestra un método para aislar células madre del cerebelo postnatal del ratón y diferenciarlas en células neuronales. Las células madre de la suspensión celular aislada se purifican utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos y se cultivan para formar neuroesferas. A continuación, las neuroesferas se mantienen en un medio de diferenciación para generar células neuronales.

Aislamiento de células madre del cerebelo postnatal de ratón y diferenciación en células neurales

Este video demuestra la generación de un modelo de lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón. Describe los pasos involucrados en la inducción de la lesión neuronal utilizando NMDA, un agonista del receptor de neurotransmisores excitatorios, y glicina, un coagonista. El NMDA y la glicina se unen a receptores neuronales específicos, lo que provoca su sobreestimulación y provoca una afluencia masiva de calcio intracelular, que provoca daño y muerte de las células neuronales.

Modelado de la lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón

Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

Aprende a cultivar neuronas cerebelosas primarias de ratón embrionario para estudiar desarrollo neuronal in vitro. Este protocolo permite analizar morfología, axones y dendritas de neuronas de Purkinje.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

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