Name: In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende a establecer líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello en ratones transgénicos B6 usando un sistema AAV-Cas9. Este protocolo simplifica la generación de modelos con alteraciones genómicas específicas para estudiar neoplasia.

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Queremos agradecer al Dr. Daniel Gitler por proporcionarnos el plásmido pAd Delta 5 Helper. Este trabajo fue financiado por la Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (a ME), la Fundación Binacional de Ciencias De Estados Unidos-Israel (BSF, 2017323) (a ME y MS), la Asociación Israelí contra el Cáncer (ICA, 20170024) (a ME), la Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (a ME) y la Concern Foundation (#7895) (a ME). Beca: la beca Alon a ME y BGU Kreitman becas a SJ y MP.

Este estudio fue aprobado por la Universidad Ben Gurion del Comité de Cuidado y Uso de Animales Negev. Los experimentos con animales fueron aprobados por la IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018(E)). Todos los aspectos de las pruebas con animales, la vivienda y las condiciones ambientales utilizadas en este estudio cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio13.
1. Producción de virus asociados a Adeno
<ol><li>Día 1: Cultivo celular<ol>
<li>Semilla 4 x 10 6 hek293T células por placa de 14,5 cm en 15 ml de DMEM. Preparar 10 placas para la transfección con polietilenimina (PEI) (1 g/L).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 2: Transfección de células HEK293T usando PEI<ol>
<li>Retire los medios y vuelva a alimentarlo con DMEM caliente 1 h antes de la transfección.</li>
		<li>Reactivos de transfección precalentados y DMEM.</li>
		<li>Utilizar 10 g del plásmido de interés que contiene AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g del plásmido cápside AAV 2/9n (con el gen de repetición de AAV2 y el gen de la tapa de AAV9, y 10 g del plásmido auxiliar (ayudante pAdDelta F5) por placa (Ver Tabla de Materiales). NOTA: Una nueva generación de plásmido auxiliar - pAdDeltaF614,15,16 que también se puede utilizar para la producción de AAV está disponible.</li>
		<li>Mezclar los plásmidos en 1 ml de DMEM liso por placa. A continuación, añadir 90 l de polietilenimina (plásmido total: concentración de PEI 1:3) a la mezcla de plásmido y vórtice brevemente.</li>
		<li>Incubar la mezcla de ADN PEI-plásmido durante 20 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Agregue la mezcla con gotas encima de las células HEK293T y transfiera las placas a la incubadora de cultivo celular a 37 oC con un 5% deCO2 durante 24 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3: Cambio medio después de la transfección<ol>
<li>Retire el medio por completo y añada 15 ml de DMEM fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 5: Cosecha del virus<ol>
<li>Prepare un baño de hielo seco/etanol.</li>
		<li>Recoger las células con un rascador de células y transferirlas en tubos de 50 ml (2 placas por tubo de 50 ml).</li>
		<li>Tubos de giro a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante de todos los tubos. Añadir 0,5 ml del tampón de lisis (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH a 8,5) por placa (es decir, 5 ml para 10 placas) solo al primer tubo. Resuspenda las células y transfiera el volumen total al siguiente tubo y continúe hasta el último tubo.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco de 50 ml. Lave los tubos con el mismo volumen de tampón de lisis (0,5 ml por placa) utilizando el mismo método de transferencia descrito en el paso 1.4.4.</li>
		<li>Sujete la suspensión celular a tres rondas de ciclos de congelación/descongelación de 10 minutos entre un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua de 37 oC. Vórtice brevemente después de cada descongelación.</li>
		<li>Si la purificación se lleva a cabo el mismo día, ajuste el tampón de equilibrio y elución (véase el Cuadro 1 para la receta) en RT.</li>
		<li>Añadir 50 unidades de benzonasa por placa e incubar a 37oC durante 1,5 h. NOTA: Benzonase se utiliza para digerir los ácidos nucleicos residuales de las células productoras del huésped y el ADN plásmido presente en la suspensión celular.</li>
		<li>Gire los tubos a 3.000 x g durante 15 min a 4 oC.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante en una jeringa con una aguja de acero de 18 G y empujar la solución a través de un filtro de 0,45 m en un tubo de 15 ml para obtener el lisato crudo.</li>
		<li>Almacene el lisado crudo a 4oC durante unas semanas hasta su purificación o continuar la purificación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purificación AAV
<ol><li>Día 5 o posterior<ol>
<li>Coloque el búfer de equilibrio y elución en RT.</li>
		<li>Lave las columnas de cromatografía con 10 ml del tampón de equilibrio.</li>
		<li>Añadir 0,5 ml por placa de heparina-agarosa a la columna17 y luego añadir el búfer de equilibrio (4 veces el volumen de la heparina-agarosa). Mezcle las soluciones invirtiendo la columna y deje que el sedimento de agarosa.</li>
		<li>Elule el búfer de equilibrio de la columna por gravedad. NOTA: Deje un poco de tampón de equilibrio para evitar que la agarosa se seque.</li>
		<li>Cargue el lisado crudo sobre la columna e incubar durante 2 h a 4 oC con agitación constante. Ponga la columna en posición vertical y deje que la agarosa se sedimente.</li>
		<li>Eluya el crudo lisado por gravedad.</li>
		<li>Lavar la columna con tampón de equilibrio (4 veces el volumen de la heparina-agarosa).</li>
		<li>Coloque un filtro de proteína centrífuga de 100 kDa debajo de la columna y eluda el virus utilizando un tampón de elución (3 veces el volumen de la heparina-agarosa) en el filtro. NOTA: El búfer de elución no debe superar los 15 ml.</li>
		<li>Centrifugar el filtro a 3.000 x g durante 30 minutos hasta que quede menos de 1 ml en el filtro.</li>
		<li>Llene el filtro con PBS y centrífuga a 3.000 x g durante 30 min hasta que quede menos de 1 ml en el filtro. Repita este paso 2x para eliminar todas las sales.</li>
		<li>Concentrar la solución del virus en el filtro por centrifugación a 3.000 x g para llegar a un volumen lo más pequeño posible (menos de 200 l).</li>
		<li>Aspirar la solución de virus con una aguja y una jeringa y empujar la solución a través de un filtro de 0,22 m en un tubo.</li>
		<li>Hacer alícuotas de partículas virales concentradas para su almacenamiento. NOTA: Las alícuotas deben ser de 20 oL para el almacenamiento a corto plazo a 4 oC y 5 oC para el almacenamiento a largo plazo a -80 oC.</li>
		<li>Determinar el titer viral y la eficiencia de transducción viral como se describió anteriormente14,18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Aislamiento y cultivo de células primarias
<ol><li>Día 1<ol>
<li>Eutanasia a un hombre o mujer de 6 semanas de edad B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia CO2 o cualquier otro protocolo aprobado por la IACUC. NOTA: Estos ratones knockin CRISPR/Cas9 tienen expresión dependiente de Cre recombinase de cas9 endonucleasa y EGFP dirigida por un promotor de CAG. La secuencia aguas arriba de Lox-Stop-Lox (LSL) presente en el genoma de estos ratones evita la expresión de Cas9 y EGFP en ausencia de Cre recombinase. Cuando se utilizan en combinación con ARN de guía única (sgRNAs) y una fuente Cre, permiten la edición de genes de ratón individuales o múltiples in vivo o ex vivo14.</li>
		<li>Disecciona la lengua de los ratones eutanasiados usando tijeras quirúrgicas.</li>
		<li>Disocia manualmente el tejido picando el tejido de la lengua en fragmentos muy pequeños usando un bisturí. Recoger los fragmentos de tejido en un tubo de 15 ml que contiene 4,5 ml de medio plano RPMI (con suero fuera).</li>
		<li>Añadir la mezcla de enzimas triples (200 l) (ver Tabla 1 para la receta) a los fragmentos de tejido.</li>
		<li>Incubar la mezcla tejido-enzima a 37 oC durante 30 minutos y toque el tubo cada 10 minutos para mejorar la disociación enzimática del tejido.</li>
		<li>Añadir un 5% de suero bovino fetal (FBS) que contenga HBSS/PBS a la mezcla tejido-enzima para detener la acción enzimática.</li>
		<li>Filtre la suspensión celular anterior a través de una malla de nylon estéril de 70 m para separar las células dispersas y fragmentos de tejido más grandes.</li>
		<li>Lavar la suspensión de celda filtrada por centrifugación durante 300 x g durante 5 min en HBSS/PBS a RT.</li>
		<li>Resuspende el pellet en medio de cultivo (10% FBS en RPMI/DMEM) y crece en platos de cultivo de 60 mm hasta que se formen colonias celulares distintas.<ol>
<li>Los agregados de células de cultivo se conservan en la parte superior del filtro en una placa de cultivo de 60 mm que contiene 3 ml de medios completos (10% FBS en RPMI/DMEM) hasta que se forman colonias celulares.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Examine microscópicamente las células primarias para detectar la presencia de contaminación por fibroblastos después de 1 semana de cultivo. Tratar las células primarias desarrolladas a partir de agregados y suspensiones celulares con 0.25 solución de trippsina 0.02% EDTA a 37 oC durante 1 min para eliminar los fibroblastos. NOTA: Por lo general, el cultivo primario de los agregados celulares produce más colonias en comparación con las suspensiones de una sola célula. Las células de estas colonias proporcionan una mejor eficiencia de transducción con la transducción AAV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transducción AAV de células primarias
<ol><li>Día 10<ol>
<li>Semilla 2 x 105 células primarias por pozo en 6 placas de pozo en 2 ml de medios completos (10% FBS en RPMI/DMEM).</li>
		<li>Al día siguiente, transducir las células con 1012 genomas/ml virales (1010 unidades de transducción/ml) e incubar las células en medios virales que contienen partículas durante 48 h a 37 oC.</li>
		<li>Retire el medio viral que contiene partículas y alimente las células transducidas por AAV con medios completos. NOTA: Sólo las células que se sometieron a transducción expresarán la FPG y comenzarán a proliferar. Las células que no fueron transductivas eventualmente morirán dentro de 2 semanas.</li>
		<li>Después de 2 semanas de expansión del cultivo, sembrar las células para la validación y los experimentos tumorigénicos in vivo. NOTA: El ADN genómico de las células transducidas por AAV y las células primarias normales de los ratones Cas9 se extrajeron para validar la edición específica del genoma utilizando protocolos estándar. La secuenciación del ADN extraído y el análisis de los datos secuenciados(Tabla 2) se realizaron utilizando un ensayo de secuenciación de próxima generación basado en la captura de hibridación (por ejemplo, plataforma MSK-IMPACT) como se describió anteriormente21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validación de la transformación de células normales a células tumorigénicas mediante inmunofluorescencia y hincha occidental
<ol><li>Inmunofluorescencia<ol>
<li>Semilla 2 x 105 células en tapas de vidrio de 12 mm y colóquelas en una incubadora durante la noche.</li>
		<li>Fijar células en 4% paraformaldehído en PBS (pH a 7.4) y proceso para el etiquetado de inmunofluorescencia.</li>
		<li>Incubar las células fijas con el primer anticuerpo primario en 1% de BSA o 1% de suero en PBST en una cámara humidificada durante 1 h a RT o durante la noche a 4oC. Los anticuerpos principales utilizados son el conejo monoclonal anti-KRT 14, el anticuerpo anti-E-cadherin a conejo monoclonal y el ratón Cas9 mAb.</li>
		<li>Retire la solución de anticuerpos primarios de los cubretapas lavando las células 3 veces durante 5 min con 1x PBS.</li>
		<li>Incubar las células con Cy3 burro anticonejo anticonejo IgG y / o Cy3 cabra anti-ratón IgG anticuerpos secundarios en 5% BSA en PBST durante 1 h en RT en la oscuridad.</li>
		<li>Retire la solución secundaria de anticuerpos de los cubrepies y lave las células 3veces como se describe en el paso 5.1.4.</li>
		<li>Monte los cubreobjetos con una gota de medio de montaje que contenga DAPI (DAPI Fluoromount).</li>
		<li>Conservar en la oscuridad a 4oC hasta que las diapositivas se muestren con microscopía de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Hincha occidental<ol>
<li>Semilla 1 x 106 células transformadas en un plato de cultivo de 100 mm y colóquelas en una incubadora durante la noche.</li>
		<li>Lave y raspe las células transformadas en PBS helado de 200 l.</li>
		<li>Centrifugar el tubo que contiene la suspensión celular durante 10 min a 2.000 x g a 4 oC para peletizar las células.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y la lentitud de las células utilizando tampón de lisis (ver Tabla 1) que contiene cócteles inhibidores de la fosfatasa y un inhibidor de la proteasa durante 10 min a 4 oC. Centrifugar los lysates durante 10 min a 10.000 x g y 4oC y recoger los lysates despejados.</li>
		<li>Utilice un kit de ensayo Bradford disponible comercialmente para determinar la concentración de proteínas siguiendo el protocolo del fabricante. Utilice un tampón de muestra 4x (500 mM Tris pH a 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% de azul bromofenol) para ajustar las muestras de proteínas a 0,5 o 1 g/L. Hervir a 96 oC durante 5 min. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC o hasta que se realice un análisis de la mancha occidental.</li>
		<li>Separar las cantidades iguales de lisato total (30 g) por 10% de electroforesis de gel de dodecilo sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Asegúrese de que el tinte llegue a la parte inferior del gel. Transfiera la proteína a la membrana de nylon mediante una hinchazón semiseca a 25 V durante 30 min.</li>
		<li>Vierta 5% De BSA en solución salina tris tamponada (TBS)-0.1% Tween (TBST) sobre la membrana para cubrirla completamente. Bloquear la membrana durante 1 h en RT. Incubar la mebrana con anticuerpos primarios (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-a catenina, anti p53, anti-fosfo-ERK, y anti-a-actina diluida en 5% BSA TBST) a 4 oC durante la noche.</li>
		<li>Después de la incubación, lavar las membranas durante 10 min con 1 tbST asegurándose de que la solución cubre completamente la membrana. Realice este lavado 3x, y luego agregue el anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluido 1:10,000 en 5% BSA TBST) a la membrana. Incubar durante 1 h a RT.</li>
		<li>Después de la incubación, lavar las membranas durante 10 min con 1 tbST asegurándose de que la solución cubre completamente la membrana. Realice la toma de imágenes de quimioluminiscencia (ver Tabla de Materiales)para exponer las bandas y capturar las imágenes en consecuencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Validación del potencial tumorígeno de células transformadas en ratones inmunocompetentes NOTA: Los ratones fueron mantenidos y tratados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad Ben-Gurion del Negev. Cabeceo. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) y ratones C57BL/6 se utilizaron para los estudios in vivo. Los ratones fueron alojados en armarios de flujo laminar filtrados por aire con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y fueron alimentados con alimentos y agua ad libitum.<ol>
<li>Use NOD hembra de 6-8 semanas de edad. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) y C57BL/6 para el estudio.</li>
		<li>Trippsinizar las células transformadas AAV-Cas9. Detenga la trippsinización con DMEM precalentado a 37 oC y recójala en un tubo de 50 ml.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 800 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medio DMEM sin FBS. Realice la centrifugación de nuevo y vuelva a suspender el pellet celular en 1x PBS. NOTA: No mantenga las células en 1x PBS durante demasiado tiempo. Mantenga siempre la suspensión celular sobre hielo para evitar que se agrupe las células.</li>
		<li>Utilice un contador de células automático para contar las células y diluir las células a la concentración deseada (2,5 x 107 células/ml) utilizando 1pbS. Generar tumores a través de una inyección subcutánea de la suspensión celular transformada AAV-Cas9 en el flanco derecho de cada NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) ratón (2 x 106 celdas/ratón). Para generar un modelo ortotrópico en ratones singéricos, inyectar 0,5 x 106 células primarias o las células transformadas AAV-Cas9 en la lengua de ratones inmunocompetentes C57BL/6.</li>
		<li>Euthanizar a los animales 2 semanas después de la inyección por asfixia de CO2, y diseccionar los tumores de los ratones eutanasiados para el análisis de inmunohistoquímica.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).</li>
<li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li>
<li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+CRISPR%2FCas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors%3A+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li>
<li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+Project+GENIE%3A+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li>
<li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+update+on+cancer%3A+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).</li>
<li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).</li>
<li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li>
<li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li>
<li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , National Academy Press. (1996).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo%3A+role+of+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
<li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+%28AAV%29+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li>
<li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+%28MSK-IMPACT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li>
<li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li>
<li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).</li>
<li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).</li>
<li>Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li>
<li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li>
<li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li>
<li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+AXL+expression+by+AP-1%2FJNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341(2019).</li>
<li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).</li>
<li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology-Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).</li>
<li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490(2016).</li>
</ol>

M.S. forma parte del Consejo Asesor del Instituto de Biociencia, y Menarini Ricerche ha recibido fondos de investigación de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics y Menarini Ricerche. M.S. también es cofundador de Medendi Medical Travel, y en los últimos 2 años, ha recibido honorarios de Menarini Ricerche y ADC Pharma. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

Varios métodos se han utilizado previamente para transformar células primarias en cultivo con grados variables de éxito25,26,27,28. La mayoría de estos métodos utilizan células de fibroblastos de ratón para la transformación14,17,18,19 o utilizan carcinógenos como 4-n...

La HNC es una neoplasia maligna común en todo el mundo1. El modelado de la génesis de la neoplasia HNC se encuentra actualmente en un punto de inflexión científico2. Si bien se han identificado muchas mutaciones genéticas en HNC2,3,4 (por ejemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 y RAS) las combinaciones específicas de alteraciones genómicas necesarias en concierto para inducir la HNC siguen sin estar claras.
El uso actual de líneas celulares HNC humanas ha ayudado significativamente a dilucidar los mecanismos asociados con la patogénesis y el tratamiento3. Sin embargo, el estudio de las líneas celulares humanas en sistemas murinos inmunocomprometidos tiene sus limitaciones, porque estos sistemas no abordan el proceso neoplásico in vivo, el papel de mutaciones genéticas específicas y las respuestas de tratamiento en un microambiente inmune. Por lo tanto, el desarrollo y establecimiento de líneas celulares murinas con alteraciones genéticas específicas son de importancia primordial para estudiar cómo los diferentes genes contribuyen al proceso de transformación y para probar nuevas terapias basadas en moléculas en ratones inmunocompetentes.
Los estudios de la función génica en la investigación biomédica se han visto significativamente afectados por los avances en las tecnologías de edición de ADN, mediante la introducción de roturas de doble cadena (DSB), por ejemplo5. Estas tecnologías, incluido el uso de nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción y las repeticiones palindrómicas cortas regulables agrupadas (CRISPR/Cas9), permiten la manipulación de cualquier gen de interés en su locus. Los últimos sistemas CRISPR/Cas9 se componen de un ARN guía (gRNA) que ordena a la nucleasa Cas9 que genere un OSD en un sitio específico del genoma. Este sistema ha ganado un amplio reconocimiento en la modificación de genes endógenos en cualquier célula o tejido diana, incluso en los organismos más tradicionalmente difíciles de tratar5. Tiene múltiples ventajas sobre otros sistemas debido a su simplicidad, velocidad y eficiencia.
En oncología, la tecnología CRISPR/CAS9 ha cumplido la necesidad de imitar eficazmente las células cancerosas. Para establecer este sistema en HNC, manipulamos el potente oncogén KRAS y dos genes supresores de tumores importantes, APC y p536. Según la base de datos GENIE7,esta combinación es rara en HNC. Las mutaciones de RAS (HRAS, NRAS y KRAS) están presentes en sólo el 7% de todas las poblaciones de HNC. Estos tumores tienden a ser resistentes a la terapia8,9.
La entrega de Cas9 y su ARNm se logra a través de la transducción viral utilizando AAVs o lentivirus. El AAV recombinante es a menudo el método preferido para la entrega de genes a las células diana debido a su alto títer, respuesta inmune leve, capacidad de transducción de una amplia gama de células, y seguridad general. Utilizando un sistema AAV, se han generado varias líneas celulares de ratón específicas del tejido, y todavía se están desarrollando nuevas líneas celulares10,11,12. Sin embargo, aún queda por desarrollar un sistema de edición genómica eficiente que pueda generar modelos de líneas celulares HNC murinos. En este estudio, buscamos desarrollar un sistema in vitro basado en AAV-Cas9 para transformar las células primarias de la lengua murina en un estado tumorigénico. Este protocolo único de transformación CRISPR/Cas9 y la línea celular tumoral establecida se pueden utilizar para comprender mejor la biología de la HNC inducida por una diversidad de alteraciones genómicas.

<table><tbody><tr><td><Anticuerpos > fuertes</Fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ratón HRP Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td></td></tr><tr><td>Anti conejo HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr>Tecnología de señalización de <td>células</td><td>mAb de ratón Cas9</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>Cre</td><td>BioLegend</td><td>900901</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure IgG anti-ratón de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-062</td><td></td></tr><tr><td>Cy-AffiniIgG anti-conejo de cabra</td><td>pura Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9996</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4370</td><td></td></tr><tr>Tecnología <td>de señalización celular</td> <td>monoclonal anti E cadherina de conejo</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Conejo monoclonal anti-KRT 14</td><td>Abcam</td><td>AB-ab181595</td><td></td></tr> <tr><td>y beta; actina</td><td>MP Biomedicals</td><td>691001</td><td></td></tr> <tr><td>y beta; tecnología</td><td>de señalización celular</td> de catenina <td>9582S</td><td></td></tr><tr><td>Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK93T</td><td>ATCC</td><td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td><td></td></tr><tr><td>strong<>Medios de cultivo, productos químicos y reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reactivo</td><td>Bio-Rad 30015484</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Amresco</td><td>0332-TAM-50G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Industrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ECL (Westar Supernova y Westar Nova 2.0)</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3.0100 y XLS071.0250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Heparina - Agarosa</td><td>Sigma</td><td>H6508</td><td></td></tr><tr><td>Aislado II Kit de ADN Genómico Bioline</td><td></td><td>BIO-52066</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Panreac AppliChem</td><td>300283</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Lab Ltd</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de estreptococos en pluma</td><td>Industrias biológicas Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasa</td><td>Biotool</td><td>B15001A/B</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris</td><td>MERCK Millipore</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Enzimas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Industrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-050-1B</td><td></td></tr><tr><td>Artículos de vidrio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Bar Naor</td><td>BNCB00130RA1</td><td></td></tr><tr><td>Deslizadores Bar</td><td>Naor</td><td>BN9308C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td><td>Jackson labs</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmidios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td><td>Broad Institute of MIT</td><td></td><td>Amable regalo del Dr. Randall J Platt y el Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT y Harvard, Cambridge, MA 02142, EE. UU.</td></tr><tr><td>AAV 2/9 vector de cápside</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAD Delta F5 ayudante</td><td>Ben Gurion Universidad del Negev</td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. Daniel Gitler, Departamento de Fisiología y Biología Celular, Facultad de Ciencias de la Salud, y Centro Zlotowski de Neurociencia, Universidad Ben-Gurion del Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td></tr><tr><td>Artículos de plástico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtros estériles, 4 mm</td><td>Millex</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0,45 y micro; m Filtros estériles, 13 mm</td><td>Millex</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus cas9 asociado con adeno

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

El uso de células epiteliales normales primarias permite inducir reproduciblemente las alteraciones genómicas necesarias para la transformación celular mediante la introducción de mutaciones específicas en oncogenes y genes supresores de tumores, utilizando tecnología de edición del genoma basada en repetición palindrómica corta (CRISPR) en ratones. Esta tecnología nos permite imitar con precisión los cambios genéticos que se producen en los cánceres humanos que utilizan ratones. Al transformar genéticamente las células primarias murinas, podemos estudiar mejor el desarrollo, la progresión, el tratamiento y el diagnóstico del cáncer. En este estudio, utilizamos células epiteliales de lengua de ratón Cas9 inducibles Cre 9 para permitir la edición del genoma utilizando virus asociado al adeno (AAV) in vitro. Específicamente, al alterar KRAS, p53 y APC en células epiteliales normales de la lengua, generamos una línea celular de cáncer de cabeza y cuello murino (HNC) in vitro, que es tumorigénica en ratones singéricos. El método presentado aquí describe en detalle cómo generar líneas celulares HNC con alteraciones genómicas específicas y explica su idoneidad para predecir la progresión del tumor en ratones singéricos. Prevemos que este método prometedor será informativo y útil para estudiar la biología tumoral y la terapia de HNC.

Uso del sistema AAV para transformar células Cas9 normales La Figura 1 proporciona un mapa vectorial detallado del plásmido transgénico AAV utilizado en este estudio. La Figura 2 describe el diseño y el funcionamiento del sistema basado en AAV-Cas9. Para producir partículas virales, las células HEK293T se transcusaron con el vector transgén al AAV y otros vectores de empaquetado viral utilizando el método de t...

El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Este protocolo permitió el desarrollo de modelos de cáncer de cabeza y cuello con operación genómica específica, lo que impactó significativamente en nuestra comprensión del papel de mutaciones genéticas específicas en el proceso de neoplasia. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad con la que la línea celular se puede desarrollar desde prácticamente cualquier órgano. Demostrando el procedimiento estará Manu Prasad un estudiante de posgrado de mi laboratorio.Comience por usar tijeras quirúrgicas para cosechar la lengua de un ratón transgénico B6 macho o hembra de seis semanas de edad. Utilice un bisturí para picar el tejido en fragmentos muy pequeños y recoger las piezas en un tubo de 15 mililitros que contiene 4,5 mililitros de RPMI medio simple sin suero. Añadir 200 microlitros de mezcla de triple enzima al tubo e incubar la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos tocando el tubo cada 10 minutos para mejorar la disociación enzimática del tejido.Al final de la incubación, detenga la reacción con 5%FBS en PBS y filtre la suspensión celular a través de un colador de malla de 70 micro metros para separar las células de los fragmentos de tejido más grandes. Recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en tres mililitros de medio completo. Luego platina las células en tres mililitros de medio completo por plato de 16 milímetros.Transfiera los agregados de celda retenidos en la parte superior del filtro a una placa de cultivo separada de 16 milímetros y agregue tres mililitros de medio completo. Mantenga ambos platos en la incubadora hasta que se forme colonias celulares distintas. Después de una semana de cultivo, examine microscópicamente los cultivos celulares primarios en busca de la presencia de contaminación por fibroblastos, tratando las células con 25%tripínsa en 02%EDTA a 37 grados Celsius durante un minuto, y elimine cualquier fibroblastos.En el día 10 del cultivo utilizan 25%trypsin en 02%EDTA durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius para cosechar las células de la suspensión celular o cultivos de agregado celular y ver dos veces 10 a las quintas células primarias en dos mililitros de medio por pozo en cada pozo de la placa de 6 pozos. Al día siguiente transducir las células con un uno por 10 a los 12 genomas virales por mililitro e incubar las células en el medio que contiene partículas virales durante 48 horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, reemplazar los sobrenadantes de cultivo con dos mililitros de medio fresco completo por pozo y devolver las células a la incubadora de cultivo celular.Después de dos semanas de expansión del cultivo, sembrar las células para la validación y experimentos tumorigénicos in vivo. Utilizando el vector AAV CAS9, se ha determinado de 10 a 12 genomas virales por mililitro de virus para transformar eficientemente las células primarias de metanfetamina en mapas tumorigénicos utilizando el protocolo como se ha demostrado. Las células transducidas Express Cre, CAS9 y Proteína Fluorescente Verde.La inyección de cinco veces 10 al quinto AAV primario transdujo mapas en la lengua, labio y piel de ratones NOD SCID, resulta en la formación de tumores en estos animales a diferencia de la inyección de mapas primarios, que no inducen tumores. La transformación tumorigénica de las células epiteliales de la lengua primaria se puede confirmar mediante inmunofluorescencia e hinchazón occidental. El análisis genómico mediante la secuenciación profunda del ADN, aislado de las células transformadas, confirma la edición eficaz de genes y el cambio de fotogramas de los genes de proteína tumoral 53 y APC por el sistema AAV CAS9.Además, las células de la lengua transformadas forman eficientemente tumores en seis ratones negros de tipo salvaje C57. El análisis inmunohistoquímico de las células tumorales neoplásicas revela la expresión citoplásmica de E-Cadherin y Keratin 14, ambos marcadores de tejido epitelial. Al intentar este procedimiento, recuerde siempre que demasiada picadura o demasiada reacción enzimática conducen a una menor viabilidad de las células, lo que conduce a una menor eficiencia de las transacciones de virus.Usando este procedimiento, las líneas celulares pueden ser modificadas genéticamente para obtener información sobre el potencial tumorigénico y metastásico de las células cancerosas de cualquier tejido de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Establishing a Murine Tumor Cell Line In Vitro Using a Virus-Cas9 System

En este video, describimos el aislamiento de células epiteliales de una lengua murina. Estas células pueden cultivarse posteriormente para dar lugar a colonias celulares.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales de lengua murina: un procedimiento para aislar y cultivar células epiteliales de lengua a partir de un modelo de ratón

Este protocolo describe un método nuevo para la entrega del virus a la próstata murina. Usando tecnología CRISPR/Cas9, sobreexpresión del gen o entrega del recombinase de Cre, la técnica permite orthotopic alteración de la expresión génica e implementa un modelo novedoso ratón para cáncer de próstata.

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.

Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Aprende a establecer líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello en ratones transgénicos B6 usando un sistema AAV-Cas9. Este protocolo simplifica la generación de modelos con alteraciones genómicas específicas para estudiar neoplasia.

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno (Video) | JoVE Journal

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

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