Name: Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a cultivar Neisseria gonorrhoeae en medio líquido con restricción de metales para caracterizar genes sensibles a metales y estudiar mecanismos de adquisición de metales en condiciones de inmunidad nutricional.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01 AI125421, R01 AI127793 y U19 AI144182. El autor de la escritura desea dar las gracias a todos los miembros del laboratorio que contribuyeron a la corrección y revisión de este método.

1. Preparación de soluciones de stock de medios definidos tratados con Chelex (CDM)
<ol><li>Solución de stock I<ol>
<li>Combine NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) y KH2PO4 (10,9 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.</li>
		<li>Filtrar esterilizar la solución y la alícuota en tubos cónicos de 50 ml.</li>
		<li>Conservar a -20oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock II<ol>
<li>Combinar tiamina HCl (0,2 g), pirofosfato de tiamina-Cl (0,05 g), pantotenato de calcio (0,19 g) y biotina (0,3 g) en etanol al 50% (vol/vol) a un volumen final de 1 L.</li>
		<li>Aliquot en tubos cónicos de 50 ml y almacenar a -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock III<ol>
<li>Combinar L-aspartato (4,0 g), L-glutamato (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serina (0,4 g), L-leucina (0,72 g L-isoleucina (0,24 g), L-valina (0,48 g), L tirosina (0,56 g), L-prolina (0,4 g), L triptófano (0,64 g), L -treonina (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagina-H2O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidina-HCl (0,2 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lisina (0,4 g), y glutatión reducido (0,36 g) en agua desionizada de 500 ml.</li>
		<li>Disolver L-cisteína (0,44 g) y L-cistina (0,28 g) en un volumen mínimo (1 ml) de 1 M HCl y añadir a la solución de aminoácidos anterior.</li>
		<li>Ajuste el pH de la solución con 10 N NaOH hasta que se disuelvan todas las partículas. El pH final será de 10,0 a 11,0.</li>
		<li>Lleve el volumen final a 1 L con agua desionizada.</li>
		<li>Filtrar esterilizar la solución y la alícuota en volúmenes de 250 ml.</li>
		<li>Conservar a -20oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock IV<ol>
<li>Disolver la glucosa (200 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L. NOTA: Es posible que la solución tenga que calentarse para disolver la glucosa.</li>
		<li>Filtrar esterilizar y alícuotar la solución en tubos cónicos de 50 ml.</li>
		<li>Conservar a -20oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock V<ol>
<li>Combine la hipoxantina (5,0 g), el uracilo (5,0 g) y el NaOH (4,0 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.</li>
		<li>Filtrar esterilizar y alícuota en tubos cónicos de 50 ml.</li>
		<li>Conservar a -20oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución VI<ol>
<li>Preparar una solución de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock VII<ol>
<li>Preparar una solución de 1 M anhidro MgSO4 en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar en RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solución de stock VIII<ol>
<li>Preparar una solución de 1 M NaHCO3 en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar en RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de 4concentrados estériles y 1x CdM
NOTA: Este procedimiento debe realizarse en cristalería estéril tratada con ácido o plástico para evitar la lixiviación de metales en las soluciones.
<ol><li>Combine las soluciones de stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) y V (20 mL) con 20,0 g de HEPES y revuelva para mezclar.</li>
	<li>Ajuste el pH a 7.4, luego lleve el volumen final a 500 ml con agua desionizada.</li>
	<li>Lavar la resina Chelex-100 en agua desionizada de 1 L para eliminar los conservantes antes de añadirla al concentrado estéril 4x. Haga esto añadiendo 50 g de resina a 1 L de agua desionizada y revolviendo durante al menos 1 h. Retire el agua por filtración al vacío y utilice esta resina lavada para el paso 2.4.</li>
	<li>Agregue 50 g de resina y revuelva lentamente durante exactamente 90 min.</li>
	<li>Retirar la resina por esterilización por filtro y almacenar el concentrado estéril 4x a 4oC.</li>
	<li>Para preparar una concentración de trabajo 1x de MCD, primero diluir el concentrado 4x con agua desionizada estéril, luego añadir la solución VI (125 l por 500 ml de solución 1x), la solución VII (535 ml por 500 ml) y la solución VIII (10 ml por 500 ml). NOTA: Aunque todas las soluciones de stock ya han sido esterilizadas, se recomienda filtrar la solución 1x de nuevo después de la preparación.</li>
</ol>3. Preparación de placas CDM
NOTA: La siguiente receta hace 1 L medios para platos, pero es mejor prepararlos en volúmenes más pequeños. Todo se reduce proporcionalmente.
<ol><li>Agarosa lavada<ol>
<li>Disolver 50 g de agarosa en 1 L de agua desionizada, revolviendo durante 1 h.</li>
		<li>Transfiera la solución a una botella de centrífuga y centrífuga a 1.200 x g durante 15 minutos a RT. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y deseche.</li>
		<li>Agregue suficiente agua desionizada para resuspender el pellet de agarosa y, a continuación, transfiera a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con agua desionizada y luego remover y centrifugar como en el paso 3.1.2. Descarta el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir suficiente 100% etanol para resuspender el pellet, luego transferir a un nuevo matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con etanol. Revuelva y centrifugar como en el paso 3.1.2.</li>
		<li>Repita el paso 3.1.4.</li>
		<li>Añadir metanol al pellet de agarosa para resuspender, luego transferir a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con metanol. Revuelva y centrifugar como en el paso 3.1.2.</li>
		<li>Repita el paso 3.1.6.</li>
		<li>Transfiera la agarosa lavada a una bandeja forrada con papel de aluminio y deje secar en una campana de humo. Cuando esté seco, transfiera a un recipiente sin metalpara su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 g de agarosa lavada y 5 g de almidón de patata a 750 ml de agua desionizada.</li>
	<li>Autoclave para 30 min a 121oC, 100 kPa por encima de la presión atmosférica.</li>
	<li>Deje que los medios se enfríen a 65 oC y, a continuación, añada 250 ml de CDM 4X, 250 ml de solución VI, 1,07 ml de solución VII y 20 ml de solución VIII.</li>
	<li>Si lo desea, añada los metales de su elección antes de verter las placas. La adición de queladores no es necesaria para mantener condiciones libres de metales.</li>
	<li>Vierta en los platos de Petri y deje solidificar.</li>
</ol>4. Crecimiento limitado de metal de Neisseria gonorrhoeae
NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones, no es necesario hacer estresar las bacterias antes de la inoculación del MCD. El paso inicial de duplicación en el MDC y la dilución posterior es suficiente para agotar los gonococos de sus reservas internas de hierro y zinc. Como tal, los dos primeros pasos del siguiente procedimiento se llevan a cabo utilizando placas de agar hechas de base media GC que se han complementado con el suplemento de Kellogg I14 y 12,5 éM Fe(NO3)3. Si se desea una tensión metálica temprana, se recomienda preparar placas base medias GC sin Fe(NO3)3 y con 5 M TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piriilmetil) etildiamina) para la quelación de zinc o 10 M de feroxamina para la quelación de hierro. Toda incubación se lleva a cabo a 37oC con 5% deCO2.
<ol><li>Dos días antes del experimento, el día -2, gonococos de rayas de las existencias del congelador en placas medianas GC e incubar durante no más de 24 h.</li>
	<li>En el día -1, rayar colonias individuales en platos medianos DE GC frescos. Trate de hacer esto 14-16 h antes del experimento de crecimiento.</li>
	<li>El día del experimento, agregue 5-10 mL 1 cdM a un matraz de brazo desconcertado de 125 ml lavado con ácido (Figura suplementaria 1) y utilícelo para dejar en blanco un colorímetro Klett.</li>
	<li>Use un hisopo estéril con punta de algodón para inocular el MDC de colonias sanas y únicas. Apunta a 20 unidades Klett. NOTA: Si un colorímetro Klett no está disponible, un espectrofotómetro también es adecuado. No hay una fórmula de conversión universal para las unidades Klett a OD, pero hay una guía aproximada disponible (<a href="https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales" target="_blank">https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales</a>).</li>
	<li>Incubar con agitación a 250 rpm hasta duplicar aproximadamente una masa (40 unidades Klett). Esto debe tomar entre 1–2 h.</li>
	<li>En este punto, los cultivos se diluyen de nuevo mediante la adición de un volumen suficiente de MDC para alcanzar la mitad de la densidad de cultivo inicial (por ejemplo, si 5 ml de cultivo ha pasado de 20 a 40 unidades Klett, 15 ml de MDC lo reducirá a 10 unidades de Klett) y el crecimiento continuará como en el paso 4.5. La cantidad específica de dilución posterior, tratamientos metálicos, etc. dependen de aplicaciones posteriores. A continuación damos tres ejemplos (secciones 5, 6 o 7).</li>
</ol>5. Análisis occidental de productos genéticos metálicos sensibles
<ol><li>A partir del paso 4.6, la espalda diluye los cultivos con tres volúmenes de MDC (por ejemplo, 15 ml de CDM si comienza con 5 ml). En este punto, añada tratamientos metálicos si lo desea.<ol>
<li>Los genes de la estención de hierro se pueden deprimir con 12,5 m de fe(NO3)3. Los genes sensibles al zinc pueden ser desprehencidos con 10 M ZnSO4.</li>
		<li>No es necesario estrés adicional en hierro o zinc, ya que los medios ya están agotados, por lo que los genes sensibles ya se expresarán. Si se desea más estrés, recomendamos no más de 1-2 M de deferoxamina o TPEN, ya que el estrés excesivo evitará que los cultivos crezcan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivar cultivos como en el paso 4.5 durante 4 h y registrar la densidad celular final de las muestras. Los cultivos menos estresados por metales crecerán a densidades finales más altas.</li>
	<li>Estandarizar los cultivos a una densidad adecuada y preparar los lysates.<ol>
<li>Estandarizar los lysates de células enteras a una densidad equivalente a 100 unidades Klett en 1 ml de cultivo. Para lograr esto, divida 100 por la densidad de la unidad Klett de su muestra. El número que se obtiene es el volumen, en mL, de cultivo que se utilizará para hacer el pellet celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siga los procedimientos estándar SDS-PAGE y Western blotting15 para sondear las proteínas de interés.</li>
</ol>6. Ensayos de crecimiento limitados por metales
NOTA: Estos ensayos describen premezclas de crecimiento prefabricadas. La preparación de estas mezclas se describe en la sección 8.
<ol><li>Durante la duplicación de masa en el paso 4.5, pretratar los pozos de una microplaca de 96 pozos con premezclas de 10x. Además, designe tres pozos para que sirvan como espacios en blanco. A estos pozos, añadir 10 s de premezcla de 10x y 90 l de CDM.</li>
	<li>Una vez que los cultivos en los matraces de las armas laterales se hayan duplicado, agregue 100 ml de cada cultivo a un pozo no utilizado en la microplaca y mida la densidad óptica a 600 nm (OD600). Esto se puede hacer con cubetas en un espectrofotómetro, pero con un mayor número de cepas dentro de un ensayo esto puede llegar a ser engorroso y generalmente no se recomienda a menos que su espectrofotómetro pueda medir directamente desde el brazo del matraz del brazo lateral(Figura Suplementaria 2).<ol>
<li>Mientras mide la DO, coloque los matraces de nuevo en la incubadora para asegurarse de que los gonococci sigan siendo viables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule la cantidad correcta de dilución necesaria para llevar los cultivos a OD600 a 0,02. Las premezclas 10x tienen un efecto insignificante en la OD y se pueden omitir del cálculo.</li>
	<li>Diluir los cultivos con MDC en pequeños tubos de cultivo y añadir volumen suficiente para diluir las premezclas 10x a 1x en la placa. Si hay un calentador de placas disponible, mantenga la placa a 37 oC mientras trabaja.</li>
	<li>Incubar la placa durante 8-12 h con agitación en un lector de placas, tomando OD600 medidas a los intervalos deseados.</li>
</ol>7. Detección de la unión de ligandos por transportadores de metales de membrana exterior
<ol><li>Tratar los cultivos como se desea como en el paso 5.1, luego incubar con agitación durante 4 h.</li>
	<li>Poco antes de la marca 4 h, cortar tres trozos de papel de filtro y un pedazo de nitrocelulosa al tamaño aproximado necesario para caber en un aparato de manchas de puntos(Figura suplementaria 3). Remoje previamente la nitrocelulosa en agua desionizada, luego ensamble el aparato con papel de filtro debajo de la nitrocelulosa.</li>
	<li>A 4 h, registre las densidades celulares y estandarice a una densidad final apropiada. Se recomienda utilizar el 10 % de la densidad utilizada para la preparación de los lysates celulares en el paso 5. Por ejemplo, si se utiliza 100 KU en 1 ml para los lysates, esto significa 10 KU en 1 mL para estas manchas. De lo contrario, el cálculo es el mismo que se describe en 5.3.1, y los cultivos se añaden directamente a la nitrocelulosa en los volúmenes calculados en lugar de convertirlos en lisatos.</li>
	<li>Cultivos de células de pipeta en la nitrocelulosa y deje tiempo suficiente para que el papel filtrante absorba todo el líquido.</li>
	<li>Desmontar el aparato, dejar que la mancha se seque y bloquear la membrana de nitrocelulosa durante 1 h en albúmina sérica bovina al 5% o leche sin grasa (p/v) en solución salina tamponada de Tris.</li>
	<li>Vuelva a montar el aparato de manchas de puntos, reemplazando el papel de filtro con película de parafina para crear un sello a prueba de fugas debajo de la nitrocelulosa.</li>
	<li>Diluir el ligando de unión de metal de interés a 0,2 m en las células de bloqueador y sonda durante 1 h.</li>
	<li>Sifón fuera del líquido con un vacío, lavar la mancha, a continuación, seguir los procedimientos inmunológicos estándar para desarrollar la señal16. Los pasos de lavado se pueden realizar dentro o fuera del aparato.</li>
</ol>8. Carga de metal de Transferin, S100A7 y Calprotectin, y preparación de 10x Premixes
NOTA: Al igual que con la preparación de MCD, utilice vidrio lavado con ácido o plástico para la preparación de la solución.
<ol><li>Disolver la transferrina humana a 10 mg/ml (125 m) en el tampón inicial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH a 8,4). S100A7 y calprotectin se suspenden en tampón compuesto por Tris de 20 mM, 100 mM de NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol y 1 mM CaCl2,pH a 8,0).<ol>
<li>Añadir solución de ferración (100 mM de citrato de sodio, 100 mM de NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH a 8,4) a la solución de transferrina para lograr un 30% de saturación de hierro (por ejemplo, 75 ml de solución de ferración es adecuado para 5 ml de transferrina si se hace a 10 mg/ml).</li>
		<li>Añadir ZnSO4 a S100A7 o calprotectina en una proporción molar del 50% a la proteína para crear 25% de saturación (cada molécula de proteína tiene dos sitios de unión de metales). Se pueden utilizar preparaciones de 100 M S100A7 o calprotectina con 50 OM ZnSO4.</li>
		<li>Para ambos casos, permita la mezcla de extremo sobre extremo durante al menos 1 h para la carga de metal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 4 L de tampón de diálisis (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH a 7,4). Divida esto en dos volúmenes separados de 2 L y coloque uno a 4 oC.</li>
	<li>Agregue las proteínas cargadas de metal a un casete de diálisis utilizando una jeringa y marque contra el primer volumen tampón durante 4 horas a RT.</li>
	<li>Mueva el cassette al segundo volumen del búfer y marque durante la noche a 4 oC. Después de estos pasos, se deben quitar los metales no unidos. NOTA: Aconsejamos un ensayo de ácido bicincino para determinar las concentraciones de proteínas después de la diálisis.</li>
	<li>Utilice una premezcla de transferencia 10x para la utilización de la transferrina como única fuente de hierro.<ol>
<li>Preparar esta premezcla diluyendo 30% fe-transferrina humana y apo-transferrina bovina (preparada a 125 m como se describe para la transferrina humana, sin el paso de carga de hierro) a 75 m y 30 m, respectivamente, en PBS. Una premezcla de control positivo reemplaza el 30% de fe-transferrina por 75 oM de fe(NO3)3, y una premezcla de control negativo omite cualquier hierro añadido, conservando sólo la apo-transferrina bovina. En el ensayo de crecimiento, diluir 10 ml de estos concentrados con 90 ml de cultivo. Las concentraciones finales son 7,5 m 30% de fe-transferrina humana y 3 m de apo-transferrina bovina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice una versión modificada de la premezcla de transferrina 10x para la utilización de S100A7 o calprotectina como única fuente de zinc.<ol>
<li>Para una premezcla de control positivo, incorpore 50 M ZnSO4 en la premezcla de transferrina. Para un control negativo, incorpore 50 m de TPEN y omita el zinc. A continuación, tome 10 ml de cada uno de estos para cada muestra bien necesaria, y mueva ese volumen a un tubo nuevo. Añadir a esta mitad tanto volumen de PBS estéril. Por ejemplo, si 10 pozos recibirán la premezcla de control positivo, tome 100 ml de premezcla, muévalo a un tubo nuevo y agregue 50 ml de PBS. Haga lo mismo con el control negativo.</li>
		<li>Para hacer la premezcla S100A7 o calprotectin, tome 10 ml de la premezcla de control negativo por pozo necesario, muévase a un tubo nuevo y agregue la mitad de ese volumen del 25% Zn-S100A7 o calprotectin. En el ensayo de crecimiento, utilice 15 ml de premezcla y diluya con 85 ml de cultivo. Las concentraciones finales de las transferrinas siguen siendo las mismas que en el paso 8.5, con un añadido de 5 M de Zn, TPEN o S100A7/calprotectin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelissen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+nutritional+immunity+by+the+pathogenic+Neisseriae%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae.</a> Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).</li>
<li>Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+iron-responsive+genes+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+microarray+analysis+in+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).</li>
<li>Pawlik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc-responsive+regulon+of+Neisseria+meningitidis+comprises+17+genes+under+control+of+a+Zur+element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).</li>
<li>Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+through+the+three+domains+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc through the three domains of life.</a> Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).</li>
<li>Frawley, E. R., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+bacterial+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of bacterial iron metabolism.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).</li>
<li>Thompson, S., Chesher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lot-to-Lot+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lot-to-Lot Variation.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).</li>
<li>Hood, M. I., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity%3A+transition+metals+at+the+pathogen-host+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).</li>
<li>Lopez, C. A., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Dietary+Transition+Metals+on+Host-Bacterial+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions.</a> Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MntABC+and+MntH+contribute+to+systemic+Staphylococcus+aureus+infection+by+competing+with+calprotectin+for+nutrient+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese.</a> Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+against+oxidative+stress+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+a+system+tailored+for+a+challenging+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerR+controls+Mn-dependent+resistance+to+oxidative+stress+in+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).</li>
<li>Rayner, M. H., Suzuki, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+the+removal+of+trace+metal+cations+from+a+mammalian+culture+medium+supplemented+with+10%25+fetal+calf+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Biometals%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum.</a> Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).</li>
<li>Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae.+I.+Virulence+Genetically+Linked+to+Clonal+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation.</a> Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot-blot+assay+for+proteins+using+enhanced+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence.</a> Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).</li>
<li>Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Evades+Calprotectin-Mediated+Nutritional+Immunity+and+Survives+Neutrophil+Extracellular+Traps+by+Production+of+TdfH%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH.</a> Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).</li>
<li>Stork, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+piracy+as+a+mechanism+of+Neisseria+meningitidis+for+evasion+of+nutritional+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733(2013).</li>
<li>Maurakis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+interaction+between+Neisseria+gonorrhoeae+TdfJ+and+human+S100A7+allows+gonococci+to+subvert+host+zinc+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction.</a> PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937(2019).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+piracy%3A+acquisition+of+transferrin-bound+iron+by+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens.</a> Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).</li>
<li>Quillin, S. J., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+host+adaptation+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).</li>
<li>Platt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+requirement+of+Neisseria+gonorrhoeae+growing+on+a+solid+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium.</a> Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).</li>
<li>Grim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metallophore+Staphylopine+Enables+Staphylococcus+aureus+To+Compete+with+the+Host+for+Zinc+and+Overcome+Nutritional+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity.</a> MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).</li>
<li>Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+transition-metal+homeostasis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).</li>
<li>Calmettes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+Zinc+acquisition+by+the+neisserial+outer-membrane+transporter+ZnuD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD.</a> Nature Communications. 6, 7996(2015).</li>
<li>Hubert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnuD%2C+a+potential+candidate+for+a+simple+and+universal+Neisseria+meningitidis+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine.</a> Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).</li>
<li>Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neisseria+meningitidis+ZnuD+zinc+receptor+contributes+to+interactions+with+epithelial+cells+and+supports+heme+utilization+when+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).</li>
<li>Stork, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+receptor+of+Neisseria+meningitidis+involved+in+zinc+acquisition+with+vaccine+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000969(2010).</li>
<li>Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+zinc+binding+system%2C+ZevAB%2C+is+critical+for+survival+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+a+murine+lung+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model.</a> Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).</li>
<li>Ammendola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+Zn2%2B+uptake+system+ZnuABC+is+required+for+bacterial+zinc+homeostasis+in+intracellular+environments+and+contributes+to+the+virulence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica.</a> Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).</li>
<li>Gabbianelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ZnuABC+and+ZinT+in+Escherichia+coli+O157%3AH7+zinc+acquisition+and+interaction+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 11, 36(2011).</li>
<li>Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+Neisseria+gonorrhoeae+lbpB+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product.</a> Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).</li>
<li>Biswas, G. D., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lbpA%2C+the+structural+gene+for+a+lactoferrin+receptor+in+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).</li>
<li>Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+a+hemoglobin-binding+outer+membrane+protein+from+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).</li>
<li>Wong, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+haemoglobin+binding+by+HpuA+from+the+Neisseriaceae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family.</a> Nature Communications. 6, 10172(2015).</li>
<li>Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+enterobactin+binding+and+utilization+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae.</a> Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).</li>
<li>Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+manganese+in+Neisseria+gonorrhoeae+correlates+with+resistance+to+oxidative+killing+by+superoxide+anion+and+is+independent+of+superoxide+dismutase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity.</a> Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Los medios de crecimiento sirven una variedad de funciones en la investigación microbiológica. Los medios especializados se utilizan para la selección, el enriquecimiento y varias otras aplicaciones para muchos tipos únicos de estudio. Una de estas aplicaciones es la inducción de genes sensibles al metal, que normalmente se logra mediante la adición de un quelante específico que apunta a un ion metálico en particular. Este método es limitado, ya que la cantidad de quelación necesaria para varios metales traza es probable...

Neisseria gonorrhoeae causa la gonorrea de infección de transmisión sexual común. Durante la infección, la patógena Neisseria expresa un repertorio de genes sensibles al metal que permiten a las bacterias superar los esfuerzos de restricción de metales del huésped humano1,2,3. Los metales traza como el hierro y el zinc desempeñan un papel clave en muchos procesos celulares, como la unión a enzimas en sitios catalíticos, la participación en reacciones redox, y como factores estructurales en varias proteínas4,5. En condiciones limitadas por metales, los loci sensibles al metal están deprimidos y sus proteínas resultantes pueden ayudar a la adquisición de estos nutrientes. La caracterización de estos genes y proteínas presenta un desafío técnico único para el investigador. Los iones metálicos deben ser retenidos de las bacterias con el fin de inducir la transcripción de estos genes de sus loci nativos, pero la quelación efectiva de estos iones de medios cargados de metal puede ser difícil de optimizar. Los diferentes perfiles metálicos del agua de origen y la variación inherente de lote a lote6 de ingredientes en polvo significa que la cantidad de quelante necesaria para eliminar un metal específico de un medio rico variará entre diferentes ubicaciones, proveedores de ingredientes, e incluso con el tiempo dentro de un solo laboratorio como inventario químico se reemplaza.
Para evitar este desafío, describimos la preparación de un medio definido que se trata con resina Chelex-100 durante la preparación para eliminar los metales traza de la solución. Este medio es lo suficientemente denso como para permitir el crecimiento del gonococo, que es difícil de cultivar fuera del huésped humano, y permite al investigador introducir un perfil de metal específico mediante la adición de sus propias fuentes definidas y concentraciones de Metales. El método de adición controlada de metales deseados al medio agotado aumenta la consistencia experimental y permite experimentos robustos y replicables independientemente de factores como la fuente de agua y el número de lote químico. Además, este medio se puede desplegar como líquido o sólido con sólo pequeñas modificaciones, por lo que es bastante versátil.
Con el fin de demostrar la utilidad de este medio, delineamos un protocolo para su uso para el crecimiento gonococo y describimos tres experimentos exitosos para caracterizar los genes Neisseria sensibles a los metales. En primer lugar, preparamos lisiados de células enteras gonocócicas a partir de cultivos agotados por metales o suplementados y demostramos niveles variables de producción de proteínas a partir de loci sensibles al metal. A continuación, delineamos un ensayo de crecimiento restringido por zinc en el que el crecimiento gonocócico se controla mediante la suplementación de fuentes específicas de zinc útiles. Por último, mostramos ensayos de unión que demuestran células gonocócicas enteras que expresan la unión de receptores de superficie sensibles al metal a sus respectivos ligandos que contienen metal. La presentación superficial exitosa de estos receptores requiere un crecimiento en un medio agotado por metales.
El presente protocolo fue optimizado específicamente para Neisseria gonorrhoeae,pero muchos otros patógenos bacterianos emplean estrategias de adquisición de metales durante la infección7,por lo que este protocolo puede ser adaptado para el estudio de la homeostasis metálica en otras bacterias. Optimizar este medio y estos protocolos experimentales para su uso en otras bacterias probablemente requerirá una ligera modificación de las concentraciones de quelador de metal y / o tiempo de tratamiento con Chelex-100, ya que otras bacterias pueden tener requisitos de metal ligeramente diferentes que el gonococo. El hierro y el zinc son los principales metales de preocupación para las investigaciones descritas, pero otros metales (por ejemplo, manganeso) se han demostrado como críticos para las bacterias, incluyendo Neisseria8,9,10,11,12. Además, se han descrito métodos similares para caracterizaciones metálicas en el trabajo de cultivo celular eucariota, que también pueden ser considerados. 13

<table><tbody><tr><td>Matraces de 125 mL para armas laterales</td><td>Bellco</td><td>2578-S0030</td><td>Deben pedirse a medida</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>M131</td><td>Abierto en campana extractora</td></tr><tr><td>3MM Papel</td><td>GE Health</td><td>3030-6461</td><td>Llamado "papel de filtro" en el texto</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Biolona</td><td>BIO-41025</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Bloqueador de grado secante</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td>Leche en polvo descremada</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Roche</td><td>3116964001</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Transferrina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Pantotenato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8731</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Calprotectina</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Se nos suministra esto a través de un colaborador</td></tr><tr><td>Chelex-100 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>Lavar con agua desionizada antes de usar</td></tr><tr><td>Hisopo estéril con punta de algodón</td><td>Puritan</td><td>25-806</td><td>El algodón es mejor que el poliéster para esta aplicación</td></tr><tr><td>Deferoxamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Cassette de diálisis</td><td>Thermo</td><td>66380</td><td>Remojar previamente en tampón antes de usar</td></tr><tr><td>Aparato de transferencia de puntos</td><td>Schleicher & Schwell</td><td>10484138</td><td>Cierre la tapa lo más herméticamente posible antes de cargar la muestra</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>Líquido inflamable, almacenar en armario de inflamables</td></tr><tr><td>Cloruro férrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7134</td><td>Irritante, no inhalar</td></tr><tr><td>Nitrato férrico nonahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1143</td><td>Irritante, no inhalar</td></tr><tr><td>GC base media</td><td>Difco</td><td>228950</td><td>Polvo, ya contiene agar</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>L-15694</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2030</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9377</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Colorímetro Klett</td><td>Manostático</td><td>37012-0000</td><td>Utiliza la transmisión de color para evaluar la densidad</td></tr><tr><td>de cultivo L-alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-asparagina monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td>Polvo Clorhidrato</td></tr><tr><td>de L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-cistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8755</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-histidina monoclorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-triptófano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Líquido inflamable, almacenar en armario de inflamables</td></tr><tr><td>Nitrocelulosa</td><td>GE Health 10600002</td><td></td><td>Mantener en funda protectora hasta su uso</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60356</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>Sulfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0772</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>Almidón de patata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4251</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Glutatión reducido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Manéjelo con cuidado. Se puede oxidar fácilmente.</td></tr><tr><td>S100A7</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nos lo suministra un colaborador</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Fisher</td><td>S279</td><td>en polvo</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Acros Organics</td><td>383040010</td> Tiamina <td>altamente higroscópica</td></tr><tr><td> clorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>También llamado cocarboxilasa</td></tr><tr><td>TPEN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4413</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>497</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Uracilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Sulto de zinc heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204986</td><td>Irritante, no inhalar</td></tr></tbody></table>

crecimiento limitado por metales de neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de host ligands

Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands

Los metales traza como el hierro y el zinc son nutrientes vitales que se sabe que desempeñan un papel clave en los procesos procasinoticos, como la regulación genética, la catálisis y la estructura proteica. El secuestro de metales por parte de los huéspedes a menudo conduce a la limitación del metal para la bacteria. Esta limitación induce la expresión génica bacteriana cuyos productos proteicos permiten a las bacterias superar su entorno limitado por metales. La caracterización de estos genes es un reto. Las bacterias deben cultivarse en medios meticulosamente preparados que permitan un acceso suficiente a los metales nutricionales para permitir el crecimiento bacteriano manteniendo al mismo tiempo un perfil metálico propicio para lograr la expresión de los genes antes mencionados. Como tal, debe establecerse un equilibrio delicado para las concentraciones de estos metales. El cultivo de un organismo nutricionalmente fastidioso como Neisseria gonorrhoeae,que ha evolucionado para sobrevivir sólo en el huésped humano, añade un nivel adicional de complejidad. Aquí, describimos la preparación de un medio definido limitado por metales suficiente para permitir el crecimiento gonocócico y la expresión génica deseada. Este método permite al investigador quelar hierro y zinc de fuentes no deseadas mientras complementa los medios con fuentes definidas de hierro o zinc, cuya preparación también se describe. Por último, esbozamos tres experimentos que utilizan este medio para ayudar a caracterizar los productos proteicos de los genes gonocócicos regulados por metales.

Se desarrolló e implementó un medio específico definido en ausencia de trazas metálicas para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y sus productos genéticos. En el protocolo optimizado, el perfil metálico de los medios se controla mediante la adición de metales a discreción del investigador, en lugar de mediante la quelación valorada de un objetivo metálico, lo que permite un mayor control y consistencia desde el laborato...

Aquí describimos un método para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en medio líquido restringido por metal para facilitar la expresión de genes para la toma de metales. También delineamos experimentos aguas abajo para caracterizar el fenotipo de gonococci cultivados en estas condiciones. Estos métodos pueden adaptarse para ser adecuados para la caracterización de genes sensibles al metal en otras bacterias.

Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands

Trace metals such as iron and zinc are vital nutrients known to play key roles in prokaryotic processes including gene regulation, catalysis, and protein ...

Este protocolo permite a los investigadores analizar las bacterias cultivadas en condiciones que imitan más estrechamente a las que se encuentran en un huésped de mamíferos, que son metales limitados a través de un proceso llamado inmunidad nutricional. Este protocolo facilita la generación de un crecimiento bacteriano reproducible consistente en condiciones restringidas por metales y puede adaptarse para el crecimiento de muchos tipos diferentes de bacterias. Dos días antes de comenzar el experimento, raya el gonococcida de las existencias de congelador en placas medianas GC durante una incubación no más de 24 horas a 37 grados centígrados.14 a 16 horas antes del experimento de crecimiento, bistec colonias individuales en platos medianos GC frescos. El día del experimento, añada de cinco a 10 mililitros CDM a un matraz de brazo lateral lavado con ácido de 125 mililitros y utilice este colorímetro Klett de medio a blanco. Utilice un hisopo con punta de algodón estéril para inocular 20 unidades Klett de CDM de colonias individuales sanas.La generación de un inóculo de Neisseria gonorrhoeae saludable para la subcultura en las 96 placas de pozo para ensayos de crecimiento líquido es f

metal-limited-growth-neisseria-gonorrhoeae-for-characterization-metal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Stenzler, B. R. et. al., Un ensayo biosensor anaeróbico para la detección de mercurio y cadmio. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el uso de biosensores bacterianos modificados genéticamente para medir con precisión la fracción biodisponible de iones de mercurio en condiciones anaeróbicas. Al variar la concentración de sulfato de magnesio, el ensayo garantiza que el biosensor responda selectivamente a los iones de mercurio libres, como lo indican los cambios en la intensidad de la...

Ensayo de biosensor bacteriano para detectar mercurio biodisponible en condiciones anaeróbicas

Fuente: Maurakis, S. y Cornelissen, C. N. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento para cultivar Neisseria gonorrhoeae en condiciones limitadas de metales utilizando un medio definido y sin metales.

Cultivo de Neisseria gonorrhoeae en condiciones de agotamiento de metales

Fuente: Maurakis, S., et al. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra un ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales. Las bacterias mutantes y de tipo salvaje cultivadas en un medio sin metal se incuban con ligando metálico y su crecimiento se monitorea mediante un...

Ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales

Fuente: Maurakis, S. y Cornelissen, C. N. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento para detectar transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae cultivados en condiciones limitadas de metales mediante un ensayo de transferencia de puntos, que involucra la unión de ligandos, la detección de anticuerpos y...

Detección de los transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae mediante transferencia de puntos

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Para obtener información básica sobre la sorción y el reciclaje de oro de sistemas acuosos, se investigó la interacción de las nanopartículas de Au(III) y Au(0) en las proteínas de la capa S. La sorción de polímeros proteicos se investigó por ICP-MS y la de monocapas proteicas por QCM-D. El AFM posterior permite la obtención de imágenes de las nanoestructuras.

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

Un protocolo para la extracción de una chaperona de periplasmic metales de transición en el contexto de sus socios de Unión nativos y caracterización biofísica de su contenido de sustrato mediante rayos x se presenta absorción fluorescencia y radiometal.

Absorción de Metal esencial en bacterias Gram-negativas: rayos x de fluorescencia, radioisótopos y fraccionamiento de la célula

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar un biosensor microbiano anaerobio de células completas para evaluar diferentes variables ambientales afectan la biodisponibilidad de Hg y Cd a las bacterias en ambientes anóxicos.

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Este protocolo detalla la preparación de medios limitados en Zn2+, vasos de crecimiento y cultivos de semillas para producir ribosomas limitados en Zn2+ en micobacterias. Las trazas de Zn2+ conducen al crecimiento limitante de Zn2+ y describimos las características morfogénicas utilizadas como bioindicadores para verificar la limitación de Zn2+ in vitro en la bacteria modelo, Mycobacterium smegmatis, y el patógeno humano M. tuberculosis.

Uso de Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias

Aprende a cultivar Neisseria gonorrhoeae en medio líquido con restricción de metales para caracterizar genes sensibles a metales y estudiar mecanismos de adquisición de metales en condiciones de inmunidad nutricional.

Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands (Video) | JoVE Journal

Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands

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