Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas

Este protocolo permite la identificación directa de los metabolitos predichas in situ. Facilita la determinación del tipo de tejidos o células que se ven afectadas por un proceso metabólico específico. Este método es rápido y sencillo.

No requiere una complicada preparación de muestras ni extracción de compuestos, y permite la identificación y localización de compuestos de baja abundancia. Una vez obtenida la muestra biológica, enfríe el soporte y la cuchilla de un micrótomo criogénico a menos 20 grados centígrados. Si es necesario, vierta el medio de inclusión en un molde de plástico colocado dentro de la cámara del micrótomo criogénico y agregue rápidamente la muestra al medio.

Cubra la muestra con medio de inclusión adicional y ajuste la posición de la muestra al centro del molde según sea necesario a medida que la matriz se solidifique. Cuando la muestra esté lista, utilice un medio de inclusión para montar el tejido en el soporte del micrótomo criogénico y utilice la cuchilla enfriada para cortar el tejido en secciones del tamaño adecuado, modificando el grosor y la temperatura de corte según sea necesario para obtener muestras óptimas. A medida que se adquiere cada sección, use una herramienta apropiada para mover con cuidado la rebanada a un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño, y coloque un dedo debajo del portaobjetos para calentar y secar la muestra antes de colocar el portaobjetos en la cámara del micrótomo criogénico.

Cuando se hayan adquirido todos los cortes, retire lentamente los portaobjetos de la cámara y use un marcador apropiado para indicar la ubicación exacta de cada muestra en los portaobjetos. Cuando se hayan marcado todos los portaobjetos, utilice un escáner de alta resolución para escanear las muestras. Después de escanear, limpie el robot de deposición de matriz con metanol al 100% y use metanol y una toallita de precisión para limpiar cada portaobjetos, sosteniendo las muestras sin tocarlas y sin eliminar las marcas.

Coloque un cubreobjetos limpio sobre cada portaobjetos en un área sin muestra y coloque el extremo del cubreobjetos del primer portaobjetos sobre el detector óptico, luego no coloque más de seis mililitros de solución de matriz recién preparada en el depósito de deposición de matriz y agregue dos mililitros de metanol al 100% hasta un volumen total de ocho mililitros. Para la configuración de la adquisición de datos, coloque un microlitro de matriz en una placa MALDI e inserte la placa en la fuente. Haga clic en el objetivo de carga en el software del dispositivo y haga clic en el punto de la imagen que representa la placa MALDI para seleccionar la posición del punto de la matriz.

Indique el nombre y la carpeta de la muestra en la pestaña de información de la muestra. Haga clic en adquisición para iniciar la adquisición y utilice el puntero del ratón para mover ligeramente la placa de modo que el láser apunte a diferentes puntos. Una vez finalizada la adquisición, abra la pestaña de calibración y seleccione Lista de calibración HCCA en el modo cuadrático y haga clic en automático.

El resultado de la calibración global se indicará en la ventana del gráfico de calibración. Si la calibración está en el rango adecuado, haga clic en aceptar y guarde el método. Una vez finalizada la deposición de la matriz en las muestras, coloque los portaobjetos en el adaptador de portaobjetos y utilice una cubierta de plástico para recuperar la posición de las marcas.

En el software de creación de imágenes, configure una nueva ejecución de imágenes en la primera ventana que se abre en el software y asigne un nombre a la ejecución de imágenes. Seleccione el directorio de resultados y haga clic en Siguiente. Indique el tamaño del ráster, seleccione el método que se utilizará y haga clic en Siguiente.

Cargue la imagen óptica de una diapositiva escaneada y haga clic en siguiente. La imagen se abrirá en una ventana más ancha y colocará la cubierta de plástico con las marcas sobre una placa MALDI para recuperar su posición y facilitar la enseñanza. Bajo el control FTMS, coloque el objetivo de la ventana de vídeo MALDI en la posición exacta de una marca y abra la imagen flexible, luego haga clic en el mismo punto exacto de la imagen óptica.

Utilice las herramientas Agregar regiones de medición para dibujar las regiones de interés en las muestras y guardar la ejecución de imágenes. Si se van a analizar varias muestras, ejecute la secuencia de ejecución automática y utilice el ejecutor de lotes de ejecución automática para iniciar una secuencia. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, utilice la herramienta de importación por lotes para seleccionar los datos sin procesar, indicar el directorio de destino y hacer clic en importar.

Haga clic en archivo y nuevo para seleccionar la herramienta de conjunto de datos para seleccionar el tipo de instrumento utilizado para la adquisición y haga clic en más para agregar el conjunto de datos importado. Haga clic y arrastre para organizar las imágenes y verifique y modifique la configuración del rango de masa según sea necesario. Haga clic en siguiente para ver el resumen de la importación e iniciar la importación.

Visualice la relación de carga maestra en diferentes tejidos dentro de una muestra o entre diferentes muestras y haga clic en los espectros para seleccionar las relaciones de masa a carga de interés. Exporte las relaciones de masa a carga de interés como un archivo CSV desde la pestaña de objetos y haga clic en exportar. Cree un nuevo conjunto de datos en un programa de software de anotación y haga clic en proyectos e importar proyecto CSV para importar el archivo CSV en el software.

Anote con listas de analitos personalizadas, que se pueden derivar de bases de datos disponibles públicamente. El software proporciona una plantilla para crear listas de analitos. Utilice el software de predicción para realizar predicciones in silico de los metabolitos de los compuestos anotados.

Recupere la lista de metabolitos, cree una lista de analitos y utilice la lista en el software de anotación para anotar los datos sin procesar con los metabolitos predichas, luego haga clic con el botón derecho en el metabolito predicho de interés para recuperar los nombres de las enzimas involucradas en los procesos metabólicos en el software de predicción. En este ejemplo, se determinó que el fármaco Telmisartán se distribuyó a través de las muestras de tejido de las hojas de la planta. Los metabolitos del fármaco se predijeron y buscaron en los datos brutos, y las anotaciones revelaron que se detectó un metabolito de primera generación en los tejidos internos de las hojas y se degradó posteriormente en metabolitos de segunda generación que se localizaron en los tejidos internos o, de manera más general, se distribuyeron en todos los tejidos de las hojas.

Estos resultados sugieren una reacción metabólica activa en las hojas para degradar el Telmisartán. A continuación, el proceso se aplicó a varios compuestos de interés anotados en las hojas y se recuperaron las enzimas implicadas en las reacciones para investigar su papel en la respuesta de la planta a la acumulación de xenobióticos. Aunque este procedimiento es bastante sencillo, una buena preparación de la muestra es clave.

Asegúrese de tomarse el tiempo necesario para encontrar los parámetros que se ajusten a su tipo de muestra durante el corte de tejido. El tamaño de la muestra se puede utilizar posteriormente para observaciones microscópicas. Se puede teñir para obtener un panel de observaciones biológicas complementarias.