Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Este protocolo delinea los pasos necesarios para la administración de genes a través de la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB) por ultrasonido focalizado, la evaluación de la expresión génica resultante y la medición de la actividad de neuromodulación de los receptores quimiogenéticos a través de pruebas histológicas.

Nuestro protocolo permite una precisión submilimétrica de ultrasonidos focalizados en ratones. Nos permite dirigir el ultrasonido utilizando piezas impresas en 3D de bajo costo sin la necesidad de usar cirugía o equipos de ultrasonido compatibles con la resonancia magnética. La apertura de la barrera hematoencefálica por ultrasonido focalizado puede ser bastante complicada al principio.

Es fundamental que el transductor se acople correctamente al animal mediante gel desgasificado o agua y que las microburbujas no se colapsen durante la inyección. Richard Li, estudiante graduado de Caltech, demostrará el procedimiento. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesiado, use 10 unidades por mililitro de solución salina heparinizada para lavar un catéter limpio de calibre 25 a 35 y use una almohadilla de etanol para desinfectar la cola del animal.

Inserte el catéter en una vena lateral de la cola y use pegamento de tejido para asegurar el catéter en su lugar. Si la aguja se ha colocado correctamente, se observará un reflujo de sangre en el catéter. Cuando el pegamento se haya secado, retire el pelo de la cabeza del animal con crema depilatoria y coloque el ratón en un carro de resonancia magnética impreso en 3D, montando los dientes frontales en una barra de mordida con la cabeza dentro de un cono nasal.

Asegure las barras desafiladas al cráneo con una cantidad segura de presión y observe la respiración durante 30 segundos para confirmar que el animal está respirando libremente a un ritmo de una respiración por segundo. Conecte la guía de orientación a las barras de los oídos y vuelva a comprobar la respiración. Coloque el carro de resonancia magnética en un soporte de resonancia magnética y coloque el soporte dentro del orificio de un imán.

A continuación, adquiera una secuencia de resonancia magnética para localizar el ratón en el escáner, utilizando la secuencia rápida de disparo de ángulo bajo en 3D para obtener imágenes de todo el cerebro. Para realizar una resonancia magnética guiada, coloque el carro dentro de un instrumento estereotáxico y use un bloque de metal con cinta adhesiva de doble cara para asegurar el bloque en su lugar contra dos postes de soporte del instrumento estereotáxico. Transfiera las imágenes de resonancia magnética a una computadora con un programa de software de guía de ultrasonido focalizado en ejecución y abra las imágenes.

Cuando se hayan cargado todas las imágenes, haga clic con el botón derecho y haga clic en volver a formatear para volver a formatear la imagen a tres ejes. Haga clic con el botón derecho para localizar el transductor en la guía de orientación circular. En la vista sagital, ajuste la posición vertical del transductor virtual para tener en cuenta el grosor del baño de agua y la carcasa del transductor.

Indique las áreas a las que se dirigirá en el planificador de trayectorias y anote las coordenadas en una hoja de cálculo. Marque la profundidad deseada de la orientación y anote las coordenadas como se demostró anteriormente. A continuación, haga clic en enviar trayectoria y ejecutar para apuntar a cada uno de los puntos.

Para correlacionar las coordenadas de una resonancia magnética con el marco estereotáxico, coloque el transductor montado a medida sobre una guía de orientación y traslade hasta que cada uno de los tres pernos de orientación pueda pasar tanto por el soporte del transductor como por la guía de orientación. Confirme que los pernos no estén bajo tensión o inclinación y mueva el transductor 10,56 milímetros hacia adelante en la dirección anteroposterior hasta que el transductor se encuentre en el punto donde aparece el centro de una guía de orientación en la resonancia magnética. A continuación, determine la distancia desde el centro del transductor virtual hasta la región de destino y utilice el marco para mover el transductor a estas coordenadas.

Para preparar la solución inyectable, cargue 800 microlitros de solución salina y 100 microlitros de agente de contraste para resonancia magnética en un tubo de 1,5 mililitros con mezcla. A continuación, lleve una solución de microburbujas no activada a temperatura ambiente, antes de activar las microburbujas durante 45 segundos en un dispositivo de activación de microburbujas. Después de la activación, cargue lentamente 100 microlitros de microburbujas desde el centro de la solución en una jeringa de tuberculina de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21, y agregue 80 microlitros de las microburbujas en la solución del agente de contraste.

Mezcle la solución preparada invirtiendo suavemente el tubo de 1,5 mililitros durante 15 segundos para evitar la flotación. Al final de la mezcla, cargue 200 microlitros de la solución de microburbujas en una jeringa sin aguja e invierta la jeringa. Presione y retraiga el émbolo para mezclar y colocar una aguja de calibre 30 en la jeringa mientras aún está invertida.

A continuación, empuje lentamente la solución de microburbujas hasta que aparezcan gotas en el extremo de la aguja. Tan pronto como las microburbujas estén listas, ajuste la duración del pulso para la insonación a 10 milisegundos, con 120 repeticiones por segundo, con 0,3 a 0,45 mega pascales de presión en el cráneo. Retire la guía de orientación y aplique gel de ultrasonido desgasificado en la cabeza del ratón, teniendo cuidado de evitar burbujas.

Baje el transductor hasta que se coloque directamente en la parte plana del soporte de la barra auricular y marque las coordenadas en los instrumentos estereotáxicos. Diluya el virus adenoasociado de interés a una concentración de 0,5 a 2 veces 10 a la décima partícula viral por gramo de peso corporal, y cargue las partículas del virus en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30. Inyecte la solución en el catéter de la vena de cola e inyecte 80 microlitros de la solución de microburbujas en el ratón.

Para evaluar la apertura de la barrera hematoencefálica mediante resonancia magnética, registre una secuencia rápida de tomas de ángulo bajo como se demuestra. Para la estimulación de DREADD, disuelva el N-óxido de clozapina en solución salina estéril a una concentración de un miligramo por mililitro e inyéctelo por vía intraperitoneal. De 15 a 45 minutos después del parto, comience a registrar la actividad conductual del animal.

Para el análisis de la activación neuronal, utilice el tejido cerebral. Siguiendo el protocolo demostrado, se puede lograr una mejora de la señal T1 en la región del hipocampo y en otras partes del cerebro. Como se ha observado, la inmunotinción contra mCherry conduce a una detección más fiable de la expresión de DREADD En este procedimiento, recuerde manipular las microburbujas con cuidado y asegurarse de que el animal esté estable durante la resonancia magnética y la insonación.