Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

La investigación sobre modelos de insectos no canónicos, como la avispa parasitoide, es limitada porque la microinyección embrionaria es muy desafiante. Nuestro método evita este problema, permitiendo mutaciones de la línea germinal hereditarias y específicas del sitio. La inyección de pupas o hembras adultas es rápida y elimina la necesidad de equipos costosos o capacitación especializada requerida para lograr microinyecciones embrionarias exitosas.

Esta técnica no permitirá que los laboratorios especializados que no tengan acceso a equipos costosos realicen estudios funcionales en cualquier especie de insecto que estén utilizando como modelo. Después de la optimización, este método se puede utilizar para estudiar la genética funcional de muchos otros genes en Nasonia. También creemos que este método puede usarse para administrar ácidos nucleicos para la transformación genética de Nasonia u otros insectos.

Comience colocando aproximadamente 20 hembras apareadas individualmente en pequeños tubos de ensayo de vidrio taponados con algodón. Agregue dos huéspedes de S. bullata por tubo y mantenga las avispas a 25 grados centígrados y 30% de humedad relativa con un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 durante dos o tres días. Después de dos o tres días, retire suavemente las hembras con un cepillo de punta fina para evitar una sobreposición continua y una sincronía en el desarrollo de la descendencia.

Opcionalmente, las hembras retiradas pueden ser realojadas o almacenadas a cinco grados centígrados durante un máximo de un mes. Mantenga el huésped parasitado a 25 grados centígrados y 30% de humedad relativa con un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 durante siete días si la etapa de inyección deseada requiere pupas blancas, durante 13 días, si la etapa de desarrollo requerida son pupas negras, o 14 días para adultos jóvenes recién emergidos. Cuando se alcanza la etapa deseada, abra el pupario huésped con una aguja de disección para recuperar las pupas y los adultos de N. vitripennis.

Prepara un portaobjetos de vidrio aplicando una línea de pegamento escolar en el centro. Extienda el pegamento con la aguja de disección para obtener una capa gruesa, que se utilizará para alinear las pupas. Deje que el pegamento se seque durante aproximadamente dos minutos antes de transferir las pupas.

Bajo un microscopio de disección, usa una aguja de disección para aplicar pegamento en la parte posterior de la cabeza de la pupa. Une la pupa a la capa de pegamento en el portaobjetos con el abdomen hacia arriba. Alinea de 20 a 30 pupas una al lado de la otra en el portaobjetos.

Coloque el portaobjetos con las pupas y una placa de Petri para que el pegamento se desplace durante aproximadamente 10 minutos. Antes de comenzar las inyecciones, pruebe la adherencia de las pupas al pegamento empujándolas suavemente con la aguja de disección. Si la mayoría de las pupas se aflojan, prepare un nuevo portaobjetos.

Alternativamente, retire todas las pupas sueltas y proceda a inyectar las que estén correctamente adheridas al portaobjetos. Cargue un tubo de vidrio capilar en un extractor de agujas y tire de las agujas siguiendo las instrucciones del fabricante. Cargue la aguja con cinco microlitros de la mezcla inyectable preparada utilizando las puntas de pipeta del microcargador.

Abra la aguja, deslizando la punta sobre una superficie hecha de dos portaobjetos superpuestos. Alternativamente, abra la punta de la aguja con un par de pinzas finas para crear un borde afilado. Coloque el portaobjetos con las pupas alineadas bajo un microscopio de disección, luego inserte la aguja en el tubo de inyección del femtojet y apriete el cabezal de agarre.

Mirando la aguja bajo el microscopio, encienda el femtojet y configure los parámetros de presión de compensación y presión de inyección girando las perillas giratorias. Inserte con cuidado la aguja entre el segundo y el tercer segmento abdominal visible con un ángulo vertical de unos 30 grados. Inyecte con un flujo continuo hasta que todo el abdomen se vuelva verde en el caso de las pupas en etapa blanca o hasta que el abdomen aumente de tamaño en el caso de las pupas negras.

Deje de inyectarse cuando esté claro que el abdomen no puede absorber más líquido o cuando el líquido comience a fluir fuera del cuerpo. Muévase con cuidado a la siguiente pupa y repita estos pasos. Transfiera el portaobjetos con las pupas inyectadas a una placa de Petri.

Cubre el plato con su tapa y colócalo a 25 grados centígrados hasta que emerjan las avispas. Para la preparación de adultos, separe grupos de 20 hembras vírgenes en un tubo de ensayo pequeño y limpio con un pincel fino. Coloque un portaobjetos de vidrio encima del hielo y alinee a la hembra uno al lado del otro en el portaobjetos frío con el abdomen hacia arriba bajo un endoscopio de disección.

Cargue una aguja con la solución de ribonucleoproteína utilizando una punta de microcarga e inserte la aguja en el paquete de conectores del conjunto del tubo del aspirador. Sostenga a las hembras desde el lado opuesto con agujas de disección desafiladas, mientras inyecta lentamente en el abdomen. Evite tocar el ovipositor.

Esto dañará severamente esta estructura reproductiva crítica. Inserte con cuidado la aguja entre el segundo y el tercer segmento abdominal visible con un ángulo vertical de unos 30 grados. Inyecte la solución en el abdomen femenino, deteniéndose cuando no pueda entrar más líquido o cuando se observe una fuga de solución sobrante.

Muévase con cuidado a la siguiente hembra y repita estos pasos. Cuando termine, transfiera suavemente una sola hembra inyectada a un nuevo tubo con un huésped usando un pincel. Déjelos recuperarse a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora, confirme la supervivencia y devuelva los tubos a la incubadora de cría.

Después de la eclosión adulta de las pupas inyectadas, coloque las avispas individuales en un vaso para taponarlas con algodón e inserte un huésped de S. bullata. Para los experimentos de knockout de CRISPR/Cas9, permita que las hembras parasiten al huésped durante un día y reemplacen al huésped cada día durante tres días consecutivos. Colocar el huésped parasitado, a 25 grados centígrados hasta la emergencia de la descendencia masculina G0, aproximadamente de 13 a 14 días.

Bajo un microscopio de disección, examina a los machos G0 para detectar los fenotipos mutados. El gen del cinabrio es el responsable de la pigmentación de los ojos. Las avispas con ojos marrones son de tipo salvaje y las avispas con ojos rojos brillantes o variaciones entre ojos rojos y marrones son mutantes.

Este protocolo se puede utilizar para la microinyección de pupas o adultos. Las tasas de supervivencia de este procedimiento oscilan entre el 15 y el 100%Aquí se muestra la eficiencia de lograr el fenotipo deseado a través de RNAi o CRISPR sin requerir laboriosas inyecciones de óvulos. Al inyectar pupas o hembras adultas, la aguja debe ser afilada y debe introducirse de manera que el líquido no se filtre inmediatamente después de la inyección.

Si esto sucede, retire la aguja, asegúrese de que la punta esté fina y afilada, cámbiela si es necesario o inyecte en un lugar diferente. El análisis de la función se puede realizar en el gen de interés objetivo de este procedimiento. Esto responderá a una pregunta sobre la función del gen y si el gen es necesario para el fenotipo específico estudiado.