Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Se establecieron modelos animales ex vivo e in vivo para estudiar lesiones corneales mecánicas y químicas. La técnica proporciona una plataforma fácil de construir para que los investigadores estudien las lesiones mecánicas y químicas de la córnea. Para crear una herida epitelial corneal murina, marque la córnea central del ratón anestesiado con un punzón de biopsia de piel para confirmar un área bien circunscrita y bien medible de la herida.

Aplique suavemente la punzón sobre la córnea central para dejar una marca circular Desgarre el epitelio corneal hasta la capa de Bowman utilizando un removedor de anillo de óxido corneal de mano con una rebaba de 0,5 milímetros que garantice no dañar la capa de Bowman. Retire los tejidos sueltos residuales en el margen de la herida con fórceps corneales. Confirme el área de desbridamiento con tinción fluorescente poniendo una gota de solución salina normal en un papel de fluoresceína para disolver la fluoresceína y luego colocando la gota que contiene fluoresceína sobre el defecto epitelial murino para visualizarlo bajo luz azul cobalto.

Proceda con el cultivo ex vivo del modelo de herida de abrasión corneal murina presionando suavemente los bordes orbitales superior e inferior de ratones sacrificados para empujar el globo ocular hacia afuera. Introducir la punta de las tijeras corneales cerradas en el espacio retrobulbar a lo largo de la pared orbital inferior asegurándose de no penetrar en el globo ocular. Mantenga el globo ocular firme con pinzas corneales de 0,3 milímetros y luego corte el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar el globo ocular.

Para el cultivo ex vivo de globos oculares murinos, prepare una placa de 48 pocillos con cera derretida dentro del pozo y espere la solidificación, luego con la punta de las pinzas de la conjuntiva, cree un orificio redondo en la superficie de la cera solidificada para acomodar los globos oculares. Coloque los globos oculares cosechados directamente sobre la placa de 48 pocillos con fondos y paredes laterales cubiertos de cera para establecer la estabilización. Cultivar los globos oculares con DMEM que contiene 1% de suero bovino fetal con o sin antibióticos, dependiendo del propósito del estudio.

Sumerja la superficie ocular con el medio de cultivo sin hacer que el globo ocular flote y documente el curso de la cicatrización de heridas mediante la tinción de fluoresceína y la recolección de fotografías con una cámara digital bajo luz azul cobalto. Para inducir una lesión por quemadura alcalina, coloque un papel de filtro circular con un diámetro de 8 milímetros en una placa de Petri. Usando un gotero, agregue 0.5 hidróxido de sodio normal en la placa de Petri para remojar los papeles de filtro y drenar el exceso de solución del papel de filtro antes de colocarlos en la córnea de conejo anestesiada.

Después de abrir los párpados con un espéculo del párpado, asegúrese de que la membrana nictitante del conejo no interfiera con la inserción del papel de filtro y coloque el papel de filtro empapado en álcali sobre la córnea central durante 30 segundos. Retire el papel de filtro y enjuague la superficie ocular con 10 mililitros de solución salina normal para eliminar el material alcalino. Para completar el defecto corneal, desbridar el epitelio corneal dentro del área opacificada hasta la membrana de Bowman usando un removedor de anillo de óxido corneal.

Confirme el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica bajo la luz azul cobalto y retire el epitelio corneal residual con fórceps corneales. Para asegurar la condición de la herida con tarsorrafia, confirme que la membrana nictitante cubre suavemente la superficie ocular y el defecto epitelial corneal en el lado nasal. Realice una tarsorrafia temporal con o sin agentes tópicos utilizando una sutura 6-0 para proteger la superficie ocular y para evitar que el conejo se rasque, asegúrese de que la sutura para la tarsorrafia esté a 3 a 4 milímetros de los márgenes superior e inferior del párpado con cuatro a cinco lazos y nudos más largos para evitar que el conejo rompa las suturas.

En el modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón, se observó el área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en los dos milímetros centrales después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón. El cultivo ex vivo de los globos oculares murinos fijados en una placa de cultivo de 48 pocillos recubierta de cera se examinó y documentó diariamente dentro de una placa de cultivo de 48 pocillos bajo un microscopio estéreo. Un día después de desbridar el epitelio corneal murino, se reveló un defecto epitelial circular teñido con fluoresceína de 2 milímetros de diámetro en fotografías digitales obtenidas bajo luz azul cobalto.

Después de crear una lesión alcalina en el epitelio corneal del conejo, se observó tinción positiva de fluoresceína con o sin luz azul cobalto sobre la córnea central con un margen circular claro y completo. La reepitelización de la herida epitelial corneal con crecimiento interno de pannus se observó desde el limbo. Los pasos más importantes son los procedimientos para crear defectos epiteliales lisos e incluso en las superficies corneales de ratones y conejos.

Se pueden probar nuevas terapias médicas y quirúrgicas en estas plataformas. El efecto de la reepitelización puede ser monitoreado después de los procedimientos. La neovascularización corneal y la opacidad después de la lesión en este protocolo serían una necesidad insatisfecha de investigación adicional.