Administración de fármacos basada en bomba osmótica para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central

La desmielinización tiene lugar en múltiples enfermedades del sistema nervioso central. Es necesaria una técnica confiable de administración de medicamentos in vivo para remielinizar las pruebas de drogas. Este protocolo describe un método basado en bomba osmótica que permite la administración de fármacos a largo plazo directamente en el parénquima cerebral y mejora la biodisponibilidad del fármaco, con una amplia aplicación en la investigación de la remielinización.

La bomba osmótica es de gran valor para la investigación de la regeneración de mielina, especialmente para aquellos medicamentos con una vida media corta, poca permeabilidad de la barrera hematoencefálica y de varios efectos secundarios periféricos. La bomba osmótica puede evitar la barrera hematoencefálica y administrar medicamentos directamente al cuerpo calloso, lo que mejora efectivamente la biodisponibilidad de los medicamentos, especialmente para algunos medicamentos con una vida media corta. Para comenzar, asegure la cabeza de un ratón anestesiado en el aparato estereotáxico con una barra dental y barras para los oídos.

Cubra el cuerpo del animal excepto el sitio quirúrgico. Usando un bisturí, haga una incisión midsagital de un centímetro de largo de la piel desde la base del cuello hasta entre los ojos para exponer el cráneo. Usando un hisopo de algodón que contiene 30% de peróxido de hidrógeno, limpie suavemente la superficie del cráneo para visualizar las estructuras craneales.

Ajuste la altura de la barra dental y las barras de la oreja para colocar el punto lambda y el punto bregma a la misma altura. Coloque la punta de una aguja de jeringa de 10 microlitros y calibre 33 suavemente en el punto bregma, y restablezca las coordenadas X, Y y Z a cero. Mueva la jeringa al lugar de la inyección.

Perfore lentamente un pequeño orificio de rebaba a través del cráneo en el sitio de inyección sin penetrar la duramadre con un calibre de microlitro de 26 y una aguja de jeringa de 0,45 milímetros. Inserte lentamente la aguja de la jeringa de microlitro en el tejido cerebral a través del orificio hasta que se alcance una cierta profundidad. Inyecte 1,5 microlitros de lisolecitina al 1% a una velocidad de 0,5 microlitros por minuto.

Espere cinco minutos antes de sacar la jeringa y sutura la piel con 5-0 suturas quirúrgicas. Coloque el ratón que se ha sometido a cirugía solo en una jaula y controle al ratón diariamente después de la operación. Coloque tres espaciadores de ajuste de profundidad a la aguja de la cánula de infusión cerebral con adhesivo tisular para lograr una profundidad de inyección de 1,5 milímetros que esté cerca del calloso.

Llene la bomba osmótica conectando la aguja de la jeringa con un paquete de bomba a una jeringa de un mililitro y aspire el medicamento. Mantenga la bomba en posición vertical. Inserte la jeringa en la abertura en la parte superior de la bomba e inyecte lentamente el medicamento sin crear una burbuja de aire.

Extraiga lentamente la jeringa a medida que el líquido fluye fuera de la abertura. Usando tijeras o alicates, retire la brida blanca del regulador de flujo. Inserte el moderador de flujo en la bomba.

Para determinar si hay burbujas en la bomba osmótica, pese la bomba osmótica por separado, antes y después del llenado. Recorte el catéter a la longitud requerida de acuerdo con el tamaño del animal. Conecte el catéter a la cánula de infusión cerebral.

Llene el catéter con medicamentos con la jeringa sin introducir aire. Conecte el catéter al moderador de flujo para que cubra aproximadamente cuatro milímetros del moderador de flujo expuesto. Sumerja las bombas llenas en solución salina estéril al 0,9% o PBS a 37 grados centígrados durante al menos cuatro a seis horas.

Prefiere extenderse durante la noche después de la implementación. Asegure los ratones en el aparato estereotáxico nuevamente. Abra la incisión quirúrgica previamente cosida y expanda la incisión hasta los omóplatos.

Separe la piel del tejido conectivo subcutáneo en la escápula, usando alicates hemostáticos o pinzas para abrir una cavidad, y coloque la bomba osmótica en la cavidad. Con un hisopo de algodón, limpie suavemente y exponga el orificio del pasador en la superficie del cráneo creado al establecer el modelo de desmielinización. Inserte la cánula de infusión cerebral a través del agujero de alfiler perpendicularmente y asegúrela en el cráneo con adhesivo de tejido.

Retire la pestaña extraíble sobre la cánula de infusión cerebral con un par de tijeras. Sutura la incisión o adjúntela con adhesivo tisular. Coloque al animal en una jaula solo después de la cirugía.

Después de realizar la implementación, la tinción DAPI reveló que el agujero de alfiler en el tejido cerebral se encuentra justo encima de la materia blanca, lo que indica una implementación exitosa de la cánula de infusión cerebral de la bomba osmótica. El experimento de hibridación in situ se realizó con un marcador de oligodendrocitos maduros que se utilizó para etiquetar oligodendrocitos recién diferenciados. Los resultados mostraron que el tratamiento UM206 produjo más células MAG positivas en la región desmielinizada que el grupo de control.

La microscopía electrónica de transmisión de la región desmielinizada mostró que el número de axones mielinizados aumentó en el grupo de tratamiento UM206 en comparación con el grupo de control, lo que sugiere que UM206 indujo un mayor nivel de remielinización. Al preparar la bomba osmótica, tenga cuidado de no introducir ninguna burbuja en el sistema.