Name: Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a visualizar la remodelación dinámica de la membrana plasmática durante la migración de neutrófilos en la piel de ratón mediante microscopía subcelular intravital. Este método permite estudiar interacciones celulares en tiempo real.

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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer.

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Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

A pesar de décadas de avances en el campo de la migración celular y la remodelación de la membrana, muy pocos estudios han empleado la MIV para visualizar las características subcelulares en animales vivos. Los procedimientos descritos en este protocolo proporcionan una poderosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre la migración de neutrófilos en animales vivos y, más específicamente, sobre la remodelación de la membrana plasmática durante este proceso. Este enfoque permite investigar la migración de neutrófilos en condiciones fisiológicas, teniendo en cuenta la complejidad inherente del microambiente tisular. De hecho, el uso de MPM permite la visualización de múltiples características dentro del tejido huésped mediante el uso de una combinación de cepas de ratón que expresan marcadores fluorescentes seleccionados, marcaje de tejido exógeno, excitación de fluorescencia endógena y señales generadas a través de SHG o THG12,13.
Un problema potencial a tener en cuenta en este procedimiento es el fotodaño. A pesar de que la MPM es generalmente más segura que la microscopía confocal con respecto al fotoblanqueo y la fototoxicidad, se debe tener cuidado al obtener imágenes de tejidos vivos34. La fototoxicidad puede obstaculizar drásticamente los resultados mediante la creación de artefactos de imagen que van desde pequeñas motas brillantes hasta áreas más grandes de tejido dañado o la inhibición/estimulación de una variedad de vías intracelulares. Para prevenir la fototoxicidad, la potencia del láser debe mantenerse al mínimo y se deben diseñar los controles adecuados para verificar que se mantengan las condiciones fisiológicas (por ejemplo, medición del flujo sanguíneo, sondas de estrés oxidativo)35,36. Además, en este procedimiento específico, que involucra la piel, las cepas albinas son altamente recomendables, ya que la melanina presente en los animales de pelaje oscuro es más sensible a la fototoxicidad 36,37,38.
Entre las principales limitaciones del procedimiento se encuentran el sistema de microscopio utilizado y la naturaleza de los neutrófilos. Aunque el uso de MPM aumenta significativamente la profundidad de las imágenes de tejido en comparación con otras técnicas de microscopía óptica (por ejemplo, confocal, disco giratorio), la capacidad de visualizar la dinámica subcelular en el oído se restringe a las capas más externas del tejido (80-100 μm). Esto se debe a la intensa dispersión de la luz producida por la gruesa capa de ECM, lo que dificulta la investigación de la migración en las capas más profundas. Otra limitación es el hecho de que los neutrófilos tienen una vida muy corta y no se pueden mantener en cultivo el tiempo suficiente para realizar técnicas de edición de genes. Esto se puede superar mediante la ingeniería de ratones para producir neutrófilos que carecen de genes específicos o que albergan mutaciones seleccionadas, lo que, por supuesto, aumenta los costos y la duración de la investigación.
Los procedimientos descritos aquí, aunque están diseñados para investigar la dinámica de la membrana, se pueden adaptar para abordar cualquier cuestión biológica celular, no solo en neutrófilos, sino también en otros tipos de células inmunitarias y células migratorias. La información recopilada a través de la MIV de bajo aumento sobre los comportamientos celulares (por ejemplo, fenotipo migratorio, velocidad celular y direccionalidad22) se puede complementar y correlacionar con la información mecanicista adquirida a través de ISMic sobre el reposicionamiento de orgánulos, la secreción de proteínas, la endocitosis, la dinámica nuclear, la dinámica del calcio, la organización del citoesqueleto y la netosis. El uso de manipulaciones farmacológicas y/o genéticas puede poner de manifiesto el papel de vías moleculares específicas en el proceso de interés, lo que lo convierte en un enfoque único y muy potente.

La migración celular dirigida es un evento crítico que ocurre durante diferentes procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el desarrollo, la respuesta inmune, la reparación de tejidos y el inicio, progresión y diseminación tumoral 1,2. Este proceso se basa en señales quimiotácticas extracelulares específicas detectadas por sus receptores afines en la membrana plasmática y luego transducidas en señales intracelulares intrincadas. Estas vías, a su vez, activan la migración celular a través de una serie de respuestas, que incluyen la activación local del citoesqueleto, el tráfico y la remodelación de la membrana y la polarización celular3. Se han caracterizado bien dos tipos distintos de migración celular: mesénquima y ameboide4. La migración mesenquimal es relativamente lenta (<1 μm/min), depende de una fuerte adhesión entre las células y la matriz extracelular (MEC) y depende de la degradación de la matriz inducida por las metaloproteasas. Por el contrario, la migración ameboide, una característica de las células inmunitarias que responden rápidamente a las señales inflamatorias, es más rápida (>10 μm/min) y utiliza adherencias débiles para navegar a través de la MEC. Independientemente de la modalidad, la migración celular requiere una remodelación constante de la membrana plasmática que resulta en la generación de estructuras protrusivas en el borde delantero de las células, que están estrechamente coordinadas con la retracción de la membrana en la parte posterior1.
Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos subcelulares, es fundamental visualizar la dinámica de las membranas de las células migratorias con una resolución temporal y espacial adecuada. Además, dado que la remodelación de la membrana está fuertemente influenciada por las propiedades del microambiente tisular que rodea a las células migratorias, es crucial obtener imágenes de este proceso directamente en el tejido nativo, dentro de animales vivos. Esto se logra mediante el uso de microscopía intravital (MIV)5. Las primeras imágenes de IVM se realizaron hace ~ 200 años, cuando la extravasación de leucocitos se visualizó utilizando un microscopio simple de transiluminación6 y, posteriormente, la IVM se utilizó principalmente en organismos modelo semitransparentes, como el pez cebra y la Drosophila 7,8. En las últimas dos décadas, la MIV se ha utilizado con éxito para investigar procesos celulares en ratones, ratas y mamíferos más grandes como los cerdos 5,9. Esto fue posible gracias a 1) desarrollos significativos en microscopía confocal y multifotónica (MP) y 2) el aumento de la tecnología de edición de genes como CRISPR-Cas9, que ha permitido la rápida ingeniería de una variedad de modelos animales para expresar proteínas marcadas con fluorescencia y reporteros. Además, la visualización de células individuales y su microambiente durante procesos como la iniciación del tumor, la migración celular y la respuesta inmunitaria ha sido posible gracias a otras formas de marcaje exógeno, como la introducción sistémica de colorantes para marcar la vasculatura10,11, y la excitación de moléculas endógenas, como el colágeno a través de la segunda generación armónica (SHG)10, 12 y fibras nerviosas a través de la Tercera Generación Armónica (THG)11,13. Finalmente, una mejora en las técnicas para minimizar los artefactos de movimiento debidos a los latidos del corazón y la respiración ha llevado al desarrollo de la microscopía subcelular intravital (ISMic), que ha permitido a los investigadores obtener imágenes e investigar varios eventos subcelulares directamente en animales vivos a un nivel de resolución similar a los observados in vitro 14,15,16,17 . Ejemplos de ISMic incluyen la investigación de la dinámica del citoesqueleto durante la exocitosis 14,15,16,17 y la endocitosis 15, la remodelación dinámica del citoesqueleto durante la migración celular17,18, la localización y el metabolismo mitocondrial19,20 y la señalización del calcio en el cerebro21.
Este protocolo detalla los diferentes pasos y procedimientos para investigar la remodelación de la membrana celular a una resolución subcelular durante la migración de neutrófilos en la piel del oído de un ratón vivo utilizando ISMic. Este enfoque se basa en los protocolos previamente descritos22,23 y se adapta para lograr una mayor resolución espacial y temporal.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 mL Aguja</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G set de infusión alado</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x objetivo</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA, inmersión en aceite de silicona</td></tr><tr><td>40x objetivo</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, inmersión en aceite de silicona</td></tr><tr><td>60 mm</td> platos <td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL Jeringa</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK</td><td>Calidad Biológico</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td>Y</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Colador de celdas 40 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Software de visualización/análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Fluoview Software Olympus</td><td></td><td>N/A</td><td>Software de adquisición</td></tr><tr><td>FVB Ratón Strain</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB fondo</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia con gas</td><td>Patterson veterinario</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 modelo</td></tr><tr><td>Green Cell seguidor</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilizado en DMSO de grado de cultivo celular para alcanzar una concentración de 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (sin Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Calidad Biológico</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Software de visualización/análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>generado en el laboratorio</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J fondo</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Software de análisis</td></tr><tr><td>mtomato Ratón</td><td>cepa generada en el laboratorio</td><td>N/A</td><td>mT/mG, FVB fondo</td></tr><tr><td>Láser multifotónico</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro; Jeringa</td><td>L WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G aguja</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de objetivo</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de calentador</td><td>de objetivo Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de oxígeno</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sin Ca2+, Mg2+)</td><td>Calidad Biológico</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Calidad Biológico</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de etapa</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de calentador de etapa</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Cinta quirúrgica</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hipoalergénico</td></tr><tr><td>Controlador de jeringa</td><td>Harvard Apparatus PHD</td><td>Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de calentamiento</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de calentamiento</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

El estudio del reclutamiento y la función de las células inmunitarias en los tejidos ha sido un campo muy activo en las últimas dos décadas. Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células inmunitarias en llegar al sitio de la inflamación y en participar en la respuesta inmunitaria innata durante una infección o daño tisular. Hasta ahora, la migración de neutrófilos se ha visualizado con éxito utilizando varios sistemas experimentales in vitro basados en estimulación uniforme, o migración confinada bajo agarosa o canales microfluídicos. Sin embargo, estos modelos no recapitulan el complejo microambiente que encuentran los neutrófilos in vivo. El desarrollo de técnicas basadas en la microscopía multifotónica (MPM), como la microscopía subcelular intravital (ISMic), ofrece una herramienta única para visualizar e investigar la dinámica de los neutrófilos a resoluciones subcelulares en condiciones fisiológicas. En particular, la oreja de un ratón vivo anestesiado proporciona una ventaja experimental para seguir la migración intersticial de neutrófilos en tiempo real debido a su facilidad de acceso y falta de exposición quirúrgica. ISMic proporciona la resolución óptica, la velocidad y la profundidad de adquisición necesarias para rastrear los procesos celulares y, lo que es más importante, subcelulares en 3D a lo largo del tiempo (4D). Además, la obtención de imágenes multimodales del microambiente intersticial (es decir, vasos sanguíneos, células residentes, matriz extracelular) se puede lograr fácilmente utilizando una combinación de ratones transgénicos que expresan marcadores fluorescentes seleccionados, marcaje exógeno a través de sondas fluorescentes, fluorescencia intrínseca del tejido y señales generadas por el segundo y tercer armónico. Este protocolo describe 1) la preparación de neutrófilos para su transferencia adoptiva al oído del ratón, 2) diferentes configuraciones para la obtención óptima de imágenes subcelulares, 3) estrategias para minimizar los artefactos de movimiento mientras se mantiene una respuesta fisiológica, 4) ejemplos de remodelación de membrana observados en neutrófilos utilizando ISMic, y 5) un flujo de trabajo para el análisis cuantitativo de la remodelación de la membrana en neutrófilos migratorios in vivo.

Aquí, se presentan dos conjuntos diferentes de resultados para ilustrar la IVM clásica y la ISMic que proporcionan resolución celular y subcelular, respectivamente. En el primer ejemplo, se purificaron neutrófilos de un ratón de tipo salvaje (WT), se marcaron con Cell Tracker Green para teñir el citoplasma y se inyectaron en un ratón transgénico que expresaba una proteína fluorescente dirigida a la membrana plasmática (ratón mTomato, también conocido como mT/mG33, Figura 1 y Película 1 y Película 2). Este ratón receptor permitió la visualización de las características estructurales en el tejido del oído, como los vasos sanguíneos, las células residentes y los folículos pilosos (Figura 1C y Vídeo 1) a través de un enfoque basado en IVM (paso 6.8.1). Las fibras de colágeno, reveladas a través de SHG (detectadas a la mitad de la longitud de onda de la excitación), se dispusieron en una intrincada red en la dermis, donde se inyectaron los neutrófilos. A lo largo del borde de los folículos pilosos (HF), se observó una capa de células epiteliales (es decir, queratinocitos). En ocasiones, se visualizaban artefactos de pelos residuales que daban lugar a una depresión local de la piel (H). Las lesiones inducidas por láser se visualizaron fácilmente debido a su fuerte autofluorescencia detectada en todos los canales y por las alteraciones de la disposición del colágeno (Figura 1D). Una visión más completa de la arquitectura 3D de la piel y la localización de los neutrófilos inyectados se puede apreciar en la Película 1, que retrata una pila Z de la piel desde las capas externas a internas y una representación de volumen en 3D. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron a los neutrófilos tomando muestras de la piel del oído e interactuando con la MEC y el tejido del huésped (Película 2). La obtención de imágenes a esta resolución y la adquisición de una pila Z cada 30 s permite realizar el seguimiento de las células y la medición de los parámetros de motilidad (es decir, la velocidad y la direccionalidad), pero un análisis preciso y detallado de la remodelación de la membrana es un desafío a esta resolución.
En el segundo ejemplo, la remodelación de la membrana se evaluó mediante el enfoque ISMic (paso 6.8.2) utilizando neutrófilos que expresan mGFP purificados de ratones LyzM-cre mT/mG e inyectados en animales WT (Figura 2A, diagrama de flujo experimental). Utilizando el protocolo ISMic (Vídeo 3 e imágenes fijas en la Figura 2B) y tras la lesión por láser, se observa una remodelación dinámica de la membrana plasmática durante la migración, y se visualiza claramente la formación de protuberancias de la membrana en el borde delantero y la retracción de la parte posterior de las células (Figura 2 y Vídeo 3). Las secuencias de lapso de tiempo resaltadas en la Película 3 revelan la complejidad de las interacciones con el ECM. De hecho, los neutrófilos migraron a través del espacio intersticial moviéndose a lo largo de las fibras o en los espacios entre ellas. Por último, se cuantificaron aspectos cuantitativos como los cambios en la curvatura y los cambios de área en la parte delantera y trasera de las celdas para cada punto de tiempo. Utilizando la célula descrita en la Figura 2B como ejemplo, se analizó la dinámica local de la membrana plasmática mediante un algoritmo (véase el paso 7) basado en la identificación de 100 puntos límite subyacentes a la superficie celular (Figura 3A). Los cambios en la curvatura local (Figura 3B) y en el área subrayada por las protuberancias de la membrana plasmática (Figura 3C) se calcularon para cada punto límite y se informaron para cada marco de tiempo como quimogramas (Figura 3D, E). Tanto la parte delantera como la trasera de las células mantienen una curvatura más alta que el lateral de las células (Figura 3D); Los cambios en el área negativa (retracciones, regiones azules) son más evidentes en la parte posterior de las células que en el borde de ataque, donde los cambios en el área positiva son más prominentes (protuberancias, regiones rojas) (Figura 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Figura 1: IVM de neutrófilos en la piel del oído del ratón. (A) Dibujo esquemático de la configuración del oído en la platina del microscopio. (B) Diagrama de flujo experimental. (C) Imagen representativa de la piel de la oreja de un ratón mTomato inyectado con neutrófilos marcados con fluorescencia, con diferentes proyecciones. Folículo piloso (HF), vaso sanguíneo (BV), epidermis (E), dermis (D), capa de células basales (BCL) y artefacto capilar (debido a un vello residual en la superficie de la piel, H). (D) Imagen representativa de la piel del ratón después de una lesión por láser estéril: canal azul (derecha), canales verde y rojo (centro), imagen combinada (izquierda). La lesión es visible a la izquierda de la imagen por una fuerte emisión de autofluorescencia en los canales verde y rojo, así como por una interrupción de la MEC observada por la formación de un agujero en las fibras de colágeno-I. En C y D, verde: neutrófilos; Rojo: tejido huésped de ratón; Cian: Colágeno-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Figura 2: Lapso de tiempo de la migración de neutrófilos mGFP en el oído de un ratón WT. (A) Diagrama de flujo experimental. (B) Imágenes fijas representativas de la película 3. (C) Representación de volumen de la misma celda para visualizar la organización 3D de la membrana. El área de alta dinámica de la membrana se ilustra con una flecha (roja para la retracción y azul para la protuberancia). (D) Visualización en primer plano e inclinada del volumen de celda renderizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Figura 3: Canal de análisis para la cuantificación de la dinámica de membrana recopilada mediante ISMic. (A) Determinación del contorno de la célula y repartición de puntos límite (100 puntos límite) entre dos tramas consecutivas para neutrófilos mGFP descritos en la Figura 2B. (B) Los límites coloreados representan la curvatura local de la membrana determinada para cada punto límite. (C) Cambios de área local entre dos fotogramas consecutivos (actual: azul y siguiente: rojo). Las áreas verdes representan los resultados de seguimiento del movimiento local de la membrana. Las flechas amarillas indican la dirección general del desplazamiento de la membrana. (D) Quimógrafo de curvatura del límite de la célula a lo largo del tiempo. El eje vertical representa los índices de puntos límite, donde 1 y 100 representan la parte posterior de la celda según su dirección de migración. (E) Quimógrafo de cambio de área local que refleja la protuberancia de la membrana (rojo) y la retracción de la membrana (azul) de la célula a lo largo del tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Neutrófilos marcados en verde visualizados en el oído de un ratón mTomato utilizando IVM. Rojo: mTejido de ratón huésped de tomate. Cian: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 2: IVM de neutrófilos migrando en la piel de la oreja de un ratón mTomato. Los vídeos son proyecciones de máxima intensidad de una pila de imágenes adquiridas durante 27 minutos con una velocidad de fotogramas de 5 fotogramas/s. Rojo: mTejido de ratón huésped de tomate. Cian: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 3: ISMic de la remodelación de la membrana durante la migración de neutrófilos en un oído de ratón WT. Los vídeos son proyecciones de máxima intensidad de una pila de imágenes adquiridas durante 8 minutos con una velocidad de fotogramas de 10 fotogramas/s. Rojo: mTejido de ratón huésped de tomate. Cian: Colágeno-I SHG; Verde: neutrófilo mGFP; Verde claro: neutrófilo renderizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>

La migración de neutrófilos se basa en la remodelación rápida y continua de la membrana plasmática en respuesta al quimioatrayente y sus interacciones con el microambiente extracelular. En este trabajo se describe un procedimiento basado en Microscopía Subcelular Intravital para investigar la dinámica de la remodelación de la membrana en neutrófilos inyectados en el oído de ratones anestesiados.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Este método describe una técnica para estudiar la remodelación de la membrana durante la migración de neutrófilos en el animal vivo utilizando microscopía subcelular intravital. Este protocolo proporciona un enfoque único para estudiar la dinámica de la membrana durante la migración animal en condiciones físicas, y para desinvolucrar el microambiente tisular. Esta técnica se puede adaptar para abordar la remodelación de la membrana y el reposicionamiento dinámico de los órganos del citoesqueleto y el tráfico de membranas en diferentes tipos de células y células migratorias.Para empezar, añade el tinte verde fluorescente a la suspensión de neutrófilos, purificada del ratón salvaje en 1,5 mililitros de tubo recubierto de BSA. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo una agitación suave en un rotor de tubo. Administre tres lavados con HBSS, seguidos de una centrifugación a 400 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos y vuelva a suspender el pellet en una solución salina equilibrada de Hanks de un mililitro.Coloque esta suspensión en el tubo recubierto de BSA en un rotor de tubo bajo agitación suave hasta el procedimiento de inyección. Antes de la inyección, vuelva a suspender el gránulo celular en solución salina para alcanzar una densidad de 2 millones a 5 millones de células por 20 microlitros. Transfiera al animal anestesiado a una almohadilla térmica a 37 grados centígrados para mantener su temperatura corporal.Después de probar el reflejo de retirada de la pata, retire los pelos de la oreja con un recortador fino para optimizar la calidad de la imagen. Coloque al animal de lado, sostenga el borde de la oreja y aplánelo a lo largo de la almohadilla térmica con la cinta quirúrgica, luego llene una jeringa equipada con una aguja de calibre 33 con la suspensión de neutrófilos y móntela en un micromanipulador. Mueva suavemente la aguja hacia la oreja y perfore lentamente la piel.Una vez que la aguja esté dentro de la piel, empuje lentamente el pistón y entregue de dos a tres microlitros de suspensión celular. Después de repetir cuidadosamente la inyección en dos o tres áreas diferentes de la oreja, retire con cuidado la cinta quirúrgica y deje que el animal recupere la conciencia bajo supervisión. Deje que el animal descanse durante una hora antes de obtener imágenes para que el tejido y las células se recuperen del procedimiento de inyección.Asegúrese de que el microscopio esté encendido y que la platina y las lentes estén precalentadas a 37 grados centígrados antes de colocar al animal anestesiado en la platina del microscopio. Cubre el agujero en el escenario con un cubreobjetos de vidrio. Mueva al animal anestesiado al escenario con cuidado.Si se planea tomar imágenes durante más de una hora, aplique el ungüento oftálmico y asegure el sistema de perfusión basado en infusión alada. Coloque una gota de solución salina en el centro del cubreobjetos y coloque la oreja inyectada por neutrófilos encima de ella. Aplana suavemente la oreja con un bastoncillo de algodón estéril en el centro del cubreobjetos para eliminar las bolsas de aire.Asegure la oreja presionando suavemente un palo de madera a un lado de la oreja más cerca de la cabeza del animal y bloqueándola con cinta adhesiva. A continuación, encuentre un área de interés con el ocular del microscopio y cambie al modo de adquisición de múltiples fotones. Ajuste la longitud de onda de excitación del láser a 900 a 930 nanómetros para permitir la adquisición simultánea de tinte verde fluorescente, mTomato y colágeno-I.A continuación, configure el conjunto adecuado de espejos y combinaciones de filtros en los detectores para recoger la luz emitida. Determine la configuración más adecuada para la configuración de hardware. Incluso si las células migratorias se pueden rastrear con intervalos de 30 segundos a un minuto, las imágenes de eventos subcelulares con una velocidad más alta de al menos menos diez segundos en intervalos.En el enfoque clásico de microscopía intravital, utilice una lente de 30X y un escáner Galvo con un tamaño de imagen de 512 por 512 píxeles para rastrear la migración celular e investigar el tejido del ratón huésped, y establezca el desplazamiento del eje Z utilizando la etapa motorizada con un tamaño de paso de dos micrómetros para permitir la obtención de imágenes de un volumen de 30 micrómetros de profundidad cada 30 segundos. En el enfoque de microscopía subcelular intravital, utilice una lente de 40X y un escáner de resonancia con un promedio de tres veces para obtener imágenes de la remodelación altamente dinámica de la membrana con un aumento y una resolución más altos. También configure el desplazamiento del eje Z utilizando un piezoeléctrico con un tamaño de paso de un micrómetro, lo que permite obtener imágenes de volumen de 20 micrómetros de profundidad cada cuatro o cinco segundos.Induzca una lesión láser estéril para desencadenar la migración de neutrófilos enfocando un láser de excitación de alta potencia en un área estrecha de 20 por 20 micrómetros durante 10 segundos. Identificar las lesiones inducidas por el láser por sus fuertes señales autofluorescentes que aparecen en todos los canales, y por la consiguiente alteración de la disposición del colágeno. Guarde los datos al final de la experimentación para análisis posteriores.El ratón receptor permitió visualizar las características estructurales del tejido del oído, como los vasos sanguíneos, las células residentes y los folículos pilosos, a través de un enfoque basado en la microscopía intravital. Las lesiones inducidas por láser fueron fácilmente visualizadas debido a su fuerte autofluorescencia detectada en todos los canales, y por las alteraciones de la disposición del colágeno. Una vista completa de la arquitectura tridimensional de la piel y la localización de los neutrófilos inyectados retrata una pila Z de la piel desde las capas externas a internas EN una representación de volumen tridimensional.Las imágenes de lapso de tiempo mostraron a los neutrófilos tomando muestras de la piel del oído e interactuando con la matriz intracelular y el tejido del huésped. Utilizando la microscopía subcelular intravital, se visualiza claramente la remodelación dinámica de la membrana plasmática durante la migración, la formación de protuberancias de la membrana en el borde delantero y la retracción de la parte posterior de las células. Las secuencias time-lapse revelan la complejidad de las interacciones con la matriz intracelular.La dinámica local de la membrana plasmática se analizó utilizando un algoritmo basado en la identificación de 100 puntos límite subyacentes a la superficie celular. Los cambios en la curvatura local y el área subrayada por las protuberancias de la membrana plasmática se calcularon para cada punto límite y se informaron para cada período de tiempo como quimógrafos. Tanto la parte delantera como la trasera de las células mantienen una curvatura más alta que el lateral de las células.Los cambios de área negativos son más evidentes en la parte posterior de las celdas que en el borde de ataque, donde los cambios de área positivos son más prominentes. Después de la toma de imágenes, se puede recolectar, fijar y procesar tejido para teñirlo con el fin de evaluar más a fondo el objetivo de interés y dilucidar los mecanismos. Este procedimiento, diseñado para obtener imágenes de la dinámica de la membrana, se puede adaptar para abordar cuestiones más amplias de biología celular en diferentes tipos de células y células en migración en sus respectivos entornos.

imaging-neutrophil-migration-mouse-skin-to-investigate-subcellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video muestra imágenes in vivo para estudiar la dinámica de reclutamiento de neutrófilos en un sitio de infección en un ratón transgénico inmunocomprometido con neutrófilos que expresan GFP. Consiste en inyectar bacterias luminiscentes para causar una infección. Esto conduce al reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección, cuyo seguimiento se realiza mediante imágenes.

Monitorización de la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en el lugar de la infección en un modelo murino

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez...

Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

La imagen in vivo de las articulaciones es una técnica valiosa para descubrir el comportamiento migratorio de los leucocitos y la dinámica molecular dentro de las articulaciones inflamadas. Aquí presentamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Las imágenes revelan el comportamiento migratorio de los leucocitos dentro de las articulaciones

Aprende a visualizar la remodelación dinámica de la membrana plasmática durante la migración de neutrófilos en la piel de ratón mediante microscopía subcelular intravital. Este método permite estudiar interacciones celulares en tiempo real.

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Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

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