Inducción del rescate de pólipos en colonias de coral para obtener micropropagados individualizados para uso experimental de laboratorio

La micropropagación de coral todavía está en su infancia. La optimización de los protocolos para el rescate de pólipos es clave para llenar este vacío, lo que permite a los científicos usar pólipos como modelos para estudiar corales en entornos de laboratorio. El rescate de pólipos permite crear múltiples propagaciones a partir de pequeños fragmentos de coral.

Los pólipos se pueden utilizar en diferentes experimentos facilitando la observación de procesos microscópicos en corales, por ejemplo. Los arrecifes de coral están amenazados. Nuestro objetivo es utilizar este modelo replicable para desarrollar estrategias para proteger a los corales del blanqueamiento y otras amenazas ambientales de una manera eficiente y no invasiva.

Este método podría ayudar a la investigación de la fisiología del coral, las interacciones del microbioma del huésped y los mecanismos involucrados en el blanqueamiento. Tales hallazgos pueden contribuir a la optimización de los probióticos de coral, por ejemplo. Utilizar agua de mar con una salinidad adecuada es clave.

La salinidad debe comenzar a nivel del entorno natural del coral y aumentar lentamente para que el estrés no sea excesivamente dañino. Recolectar pólipos en el momento correcto y elegir aquellos que están más intactos es crucial para su supervivencia. Una demostración visual puede ser vital para entender estas señales.

Primero, use alicates de corte diagonales para cortar pequeños fragmentos de una colonia de coral, luego colóquelos en pequeñas placas de Petri llenas de 12 mililitros de agua de mar a las que se ha aclimatado la colonia de coral. Deje la placa abierta durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente para que el agua se evapore y su salinidad aumente gradualmente. Cuando la digestión del tejido es observable entre los pólipos, use una pipeta de transferencia de 1 mililitro para crear un flujo suave cerca del tejido de coral.

El flujo ayudará lentamente a completar el desprendimiento de pólipos que ya han digerido el tejido a su alrededor del esqueleto, luego con la pipeta, intercambiará lentamente el agua en la placa de Petri con agua isosmótica. Para preparar agua de mar de alta salinidad, tome agua de mar normal y agregue cloruro de sodio al agua de mar para preparar tres litros de agua de mar de alta salinidad hasta que la salinidad aumente en un 85% Después de cortar pequeños fragmentos de coral como se demostró anteriormente, colóquelos en un recipiente de 10 litros con tres litros de agua de mar isosmótica conectada a una bomba peristáltica. Llene este recipiente con tres litros de agua de mar de alta salinidad previamente preparada durante 24 horas a una velocidad de 126 mililitros por hora para aumentar la salinidad en aproximadamente un 40%Usando una pipeta, cree un flujo suave de agua para liberar los pólipos del esqueleto.

Intercambie lentamente el agua en el recipiente con agua de mar isosmótica. Agregue 26.29 gramos de cloruro de sodio, 0.872 gramos de cloruro de potasio, 2.16 gramos de sulfato de magnesio, 11.94 gramos de cloruro de magnesio, 3.42 gramos de sulfato de sodio y 0.26 gramos de bicarbonato de sodio a un litro de agua desionizada para preparar agua de mar sin calcio, luego llene las placas de Petri con esta agua de mar libre de calcio. Después de cortar pequeños fragmentos de coral, sumérgelos en agua de mar libre de calcio en las placas de Petri.

Coloque los platos en una incubadora orbital durante tres horas a una velocidad de rotación de 80 rpm, luego transfiera los fragmentos a placas de Petri llenas de 20% DMEM preparadas con agua de mar artificial de 40 unidades de salinidad prácticas y que contengan 100 miligramos por litro de ampicilina. Incubar los fragmentos a 26 grados centígrados y 80 rpm. Intercambie los medios todos los días hasta que la digestión del tejido sea observable entre los pólipos y los pólipos individuales comiencen a desprenderse del esqueleto, luego transfiera los pólipos al agua de mar esterilizada e incube durante una hora.

Una vez que los pólipos se devuelven al agua de mar filtrada con salinidad no estresante, seleccione los pólipos viables observando la integridad del tejido y el movimiento causado por el flujo ciliar bajo un microscopio estereoscópico. Coloque los pólipos seleccionados en una placa de Petri y cubra la placa de Petri con una red de plancton de 200 micrómetros de tamaño de malla para que los pólipos no floten lejos de la placa. Coloque la placa de Petri dentro de un acuario con las condiciones adecuadas para las especies de coral utilizadas.

Para evitar el crecimiento excesivo de algas, abra la placa de Petri al menos una vez a la semana para renovar el agua y limpiar la placa. Después de seleccionar los pólipos como se muestra anteriormente, usando una pipeta de transferencia, colóquelos en un matraz de celda de superficie de 75 centímetros cuadrados lleno de 50 mililitros de agua de mar isosmótica, luego cierre el matraz y colóquelos en una incubadora a ciclos de luz de 12 horas, 26 grados Celsius y 40 rpm. Si el matraz se llena de algas o biopelículas, transfiera el contenido a un matraz limpio.

En este estudio, el rescate de pólipos fue inducido por tres métodos diferentes. El método de evaporación del agua resultó en un rescate completo dentro de las 24 horas posteriores a la incubación, y la salinidad aumentó de 40 a 59 unidades prácticas de salinidad después de 24 horas. El método de suministro de agua salada también resultó en el rescate de pólipos después de 24 horas de incubación.

Aquí, la salinidad aumentó de 40 a 52 unidades prácticas de salinidad después de 12 horas de incubación, y luego a 59 unidades prácticas de salinidad después de 24 horas. La inducción de rescate a través de la incubación en agua de mar libre de calcio se completó después de tres horas de incubación de pólipos en ella, seguida de 20 horas de incubación en el medio 20% DMEM, En los tres métodos, se pudieron generar pólipos de coral individualizados. Los pólipos de coral generados por el método de evaporación podrían sobrevivir durante seis semanas, mientras que los producidos por el método de suministro de agua de mar de alta salinidad podrían sobrevivir durante ocho semanas en placas de Petri dentro de acuarios.

Los pólipos obtenidos del método de evaporación del agua de mar mantenidos en matraces de cultivo celular dentro de incubadoras sobrevivieron hasta tres semanas sin la disociación completa de sus tejidos. Al separar los pólipos del esqueleto, es importante ser suave. Si no están completamente desprendidos, forzar el desprendimiento mediante la tubería fuerte del agua causará daños y menores tasas de supervivencia.

Usando estos métodos, se puede inducir el asentamiento de pólipos. El asentamiento de pólipos puede responder preguntas sobre sus procesos de calcificación y crecimiento. Después del desarrollo de la inducción de rescate de pólipos, los investigadores pudieron estudiar la formación inicial del esqueleto de coral y visualizar directamente el blanqueamiento de corales en la escala de pólipos.