Name: Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a administrar metabolitos microbianos intestinales en el cerebro de ratones mediante cánula guía intracerebroventricular. Este protocolo validado permite estudiar el eje intestino-cerebro en animales en movimiento libre.

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Reconocemos al personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU) por cuidar a los animales. Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Educación Prof. Kun-Yen Huang de la Fundación Médica CHENG-HSING a C.-W.L.; los fondos del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) en Taiwán: (Investigación de pregrado MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; y el Proyecto Brote de Educación Superior, Ministerio de Educación a la Sede de Avance Universitario en NCKU a W.-L.W.

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo.

Los metabolitos derivados del intestino se han asociado con enfermedades mediadas por el cerebro sin mucho mecanismo preciso, en parte debido a sus múltiples sitios de unión en el cuerpo 6,12,24. Informes anteriores indicaron que los AGCC podrían servir como ligandos para receptores acoplados a proteínas G, reguladores epigenéticos y fuentes de producción de energía en múltiples sitios del cuerpo 6,1...

El tracto gastrointestinal humano alberga diversos microorganismos que impactan al huésped 1,2,3. Estas bacterias intestinales pueden secretar metabolitos derivados del intestino durante la utilización de los componentes dietéticos consumidos por el huésped 4,5. Curiosamente, los metabolitos intestinales no metabolizados en la periferia pueden ser transportados a otros órganos a través de la circulación6. Cabe destacar que estos metabolitos secretados pueden servir como mediadores para el eje intestino-cerebro, definido como la comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central y el intestino7. Estudios previos han demostrado que los metabolitos derivados del intestino pueden modular el comportamiento complejo y la emoción en animales 8,9,10,11.
Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos producidos por la microbiota intestinal durante la fermentación de la fibra dietética y los carbohidratos no digeribles6. El acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en el intestino12. Los AGCC sirven como fuente de energía para las células en el tracto gastrointestinal. Los AGCC no metabolizados en el intestino pueden ser transportados al cerebro a través de la vena porta, modulando así el cerebro y el comportamiento 6,12. Estudios previos han sugerido que los AGCC podrían desempeñar un papel crítico en los trastornos neuropsiquiátricos 6,12. Por ejemplo, la inyección intraperitoneal de butirato en ratones BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modelo animal de trastorno del espectro autista (TEA), rescató sus déficits sociales13. Las ratas tratadas con antibióticos que recibieron microbiota de sujetos depresivos mostraron un aumento en los comportamientos similares a la ansiedad y los AGCC fecales14. Clínicamente, se observaron alteraciones en los niveles de AGCC fecales en personas con TEA en comparación con los controles de desarrollo típico15,16. Las personas con depresión tienen niveles más bajos de AGCC fecales que los sujetos sanos17,18. Estos estudios sugirieron que los AGCC pueden alterar el comportamiento en animales y humanos a través de varias rutas.
Los metabolitos microbianos ejercen diversos efectos en múltiples sitios del cuerpo, afectando la fisiología y los comportamientos del huésped 4,19, incluyendo el tracto gastrointestinal, el nervio vago y el nervio simpático. Es difícil determinar el papel preciso de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro cuando se administran los metabolitos a través de rutas periféricas. Este artículo presenta un protocolo basado en video para investigar los efectos de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro de un ratón que se mueve libremente (Figura 1). Demostramos que los AGCC podían administrarse de forma aguda a través de la cánula guía durante las pruebas de comportamiento. El tipo, el volumen y la velocidad de infusión de los metabolitos pueden modificarse dependiendo del propósito. El sitio de canulización se puede ajustar para explorar el impacto de los metabolitos intestinales en una región específica del cerebro. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos un método para explorar el impacto potencial de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro y el comportamiento.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advil Liqui-Gels Ibuprofeno Solubilizado A2:D41</td><td>Pfizer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-conejo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Oro Antifluorescente (policlonal de conejo)</td><td>Millipore</td><td>AB153-I</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vacío con tapa de botella, 500 mL, 0.22 &mu; m, PES, Estéril</td><td>NEST</td><td>121921LA01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ACSF: 0,14 g/L</td></tr><tr><td>Exfoliante de clorhexidina 2%</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-611-09</td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhexidina</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-599-09</td><td></td></tr><tr><td>Maniquí comercial</td><td>RWD Life Science</td><td>62004</td><td>Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Cánula guía comercial</td><td>RWD Life Science</td><td>62104</td><td>Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Inyector comercial</td><td>RWD Life Science</td><td>62204</td><td>Single_OD 0,21 mm-33G/ Se acopla con M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>ACSF: 0,61 g/L</td></tr><tr><td>Acrílico dental</td><td>HYGENIC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tornillos de fijación</td><td>RWD Life Science</td><td>62521</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Fluoroshield con DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Suero para caballos</td><td>ThermoFisher Scientific 16050130</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>BBraun</td><td>XG-LBB-9151133S-1BX</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Panion & BF biotech</td><td>DG-4900-250D</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACSF: 0,19 g/L</td></tr><tr><td>Ketoprofeno&nbsp;</td><td>Swiss Pharmaceutical</td><td>n/a</td> Lidocaína<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>AstraZeneca</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ACSF: 0,19 g/L</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral ligero, blanco NF</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MA-6358-04</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACSF: 7,46 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>ACSF: 0,18 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>ACSF: 1,76 g/L</td></tr><tr><td>adhesivo de cianoacrilato de n-butilo (pegamento adhesivo para tejidos)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>3M Vetbond</td></tr><tr><td>Neural tracer&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-358883</td><td>FluoroGold</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>RWD Life Science</td><td>62329</td><td>OD 1.50, I.D 0.50 mm y OD 1.09, I.D 0.38 mm</td></tr><tr><td>Puralube Vet (ojo) Pomada</td><td>Dechra&nbsp;</td><td></td><td></td>12920060</tr><tr><td>Acetato de sodio &nbsp;</td><td>AGCC Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td>: <td>13,5 mM</td></tr><tr><td>azida sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio&nbsp;</td><td>AGCC Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>: 8 mM</td></tr><tr><td>de propionato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1880</td><td>SCFAs: 5.18 mM</td></tr><tr><td>Cánula guía de acero inoxidable</td><td>Chun Ta de acero inoxidable enterprise CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>OD 0,63 mm; Proveedor local</td></tr><tr><td>Inyector de acero inoxidable</td><td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>OD 0,3 mm; el maniquí está hecho de inyector; proveedor local</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td>KG94548R</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>EquipmentSoporte para</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cánula</td><td>RWD Life Science</td><td>B485-68217</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de techo</td><td>FOSCAM</td><td>R2</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estereotáxicos digitales</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>INNOVIEW</td><td>SEM-HT/TW</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio</td><td>RWD Life Science</td><td>RS1501</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica&nbsp;</td><td>Pinza</td> de microdisección Leica <td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>dentada, ligera curva; Extra delicado; Ancho de la punta de 0,5 mm; 4" de longitud&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5918</td><td>4.5" Controlador de microinyección afilada en ángulo</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>MICRO2T</td><td>Controlador SMARTouch</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa de microinyección</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>UMP3T-1</td><td>UltraMicroPump3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa de microlitro</td><td>Hamilton</td><td>80014</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>Fibra óptica Luz fría con doble paso</td><td></td><td>de fibra LGY-150</td><td>Proveedor local</td></tr><tr><td>Recortadora de mascotas</td><td>WAHL</td><td>09962-2018</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador para isoflurano</td><td>Paso</td><td>AS-01</td><td>Proveedor local</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal behavior video software de seguimiento</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Versión: 15.0.1416</td></tr><tr><td>Software Leica Application Suite X</td><td>Leica</td><td>LASX</td><td>Versión: 3.7.2.22383</td></tr></tbody></table>

entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

El impacto de la microbiota intestinal y sus metabolitos en la fisiología y el comportamiento del huésped ha sido ampliamente investigado en esta década. Numerosos estudios han revelado que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal modulan las funciones fisiológicas mediadas por el cerebro a través de intrincadas vías intestino-cerebro en el huésped. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos derivados de bacterias producidos durante la fermentación de la fibra dietética por el microbioma intestinal. Los AGCC secretados desde el intestino pueden actuar en múltiples sitios en la periferia, afectando las respuestas inmunes, endocrinas y neuronales debido a la vasta distribución de los receptores de AGCC. Por lo tanto, es difícil diferenciar los efectos centrales y periféricos de los AGCC a través de la administración oral e intraperitoneal de AGCC. Este documento presenta un método basado en video para interrogar el papel funcional de los AGCC en el cerebro a través de una cánula guía en ratones que se mueven libremente. La cantidad y el tipo de AGCC en el cerebro se pueden ajustar controlando el volumen y la velocidad de infusión. Este método puede proporcionar a los científicos una forma de apreciar el papel de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro.

El ratón fue infundido con AGCC 1 semana después de la recuperación de la implantación de la cánula guía para evaluar la actividad locomotora en una nueva jaula. El ratón se colocó en una jaula novedosa y se infundió con 2.100 nL de AGCC o ACSF en los primeros 5 minutos (tasa de entrega de 7 nL / s) en el cerebro a través de la cánula de guía comercial implantada en el ventrículo lateral del cerebro. La actividad locomotora en una nueva jaula se registró durante 30 minutos adicionales después de la infusión. No se observ...

Los metabolitos microbianos derivados del intestino tienen efectos multifacéticos que conducen a un comportamiento complejo en los animales. Nuestro objetivo es proporcionar un método paso a paso para delinear los efectos de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro a través de la administración intracerebroventricular a través de una cánula guía.

Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

Los metabolitos liberados por la microbiota intestinal producen efectos complejos en el huésped. Este protocolo presenta un método para interrogar el papel de los metabolitos intestinales en el cerebro y el comportamiento del ratón. Esta técnica proporciona un método preciso, meticuloso y validado para administrar metabolitos intestinales en un cerebro en ratones que se mueven libremente.Proporcionamos una mejor metodología integral y fisiológica para comprender la investigación del eje cerebral intestinal. Coloque el ratón en el marco estereotáxico y fije los incisivos del ratón en la barra incisiva en el soporte del incisivo estereotáxico. Cubra la nariz con la máscara del cono nasal.Luego evalúe la nocicepción del ratón a través del reflejo de pellizco superior y asegúrese de una frecuencia respiratoria constante antes de incidir el sitio quirúrgico. Una vez que el pelaje recortado en la cabeza se retira con la cinta adhesiva, inyecte por vía subcutánea el analgésico ketoprofeno para aliviar el dolor y aplique ungüento para los ojos. A continuación, fije la cabeza insertando la barra auricular puntiaguda en el canal auditivo.Apriete la abrazadera nasal en el soporte del incisivo y presione la cabeza suavemente para asegurarse de que la cabeza esté fija. Use 3 exfoliantes alternados de hisopo de clorhexidina para desinfectar el cuero cabelludo. Ahora, use bisturí disecante para hacer una incisión de menos de un centímetro en el cuero cabelludo de manera posterior anterior.Después de abrir la incisión, limpie el cráneo con un hisopo de algodón sostenido por pinzas de micro disección. Con base en las coordenadas estereotáxicas, identifique y etiquete la posición del ventrículo lateral derecho como se describe en el manuscrito. Luego, perfore un agujero a través del cráneo en el sitio etiquetado con un taladro estereotáxico, y más tarde, perfore de dos a cuatro agujeros más en el cráneo.Limpie el cráneo con un hisopo de algodón de lidocaína y monte de 2 a 4 tornillos inoxidables en los agujeros. Coloque la cánula de guía comercial en el soporte de cánula estereotáxica y desinfecte con el esterilizador de velocidad de vidrio a 150 grados centígrados. Luego, mueva el soporte de la cánula estereotáxica al orificio perforado para el ventrículo lateral e inserte lentamente la cánula de guía comercial en el orificio hasta que se alcance la profundidad deseada.Ahora aplique 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato de n-butilo para fijar la cánula de guía comercial en el orificio perforado y espere de 3 a 4 minutos. Suelte la cánula de guía comercial suavemente del soporte de la cánula estereotáxica y aplique acrílico dental en el cuero cabelludo inciso para fijar la cánula de la guía comercial y espere al menos 5 minutos. Implante el maniquí comercial en la cánula de guía comercial.Luego, coloque al ratón en una nueva jaula con una almohadilla térmica debajo para recuperarse de la anestesia y observe continuamente hasta que el ratón se despierte por completo. Monte la jeringa de microlitros, que contiene 10 microlitros de agua destilada, en la bomba de microinyección. Con una jeringa de insulina, llene el tubo de polietileno con agua destilada y conecte la jeringa de microlitros al tubo de polietileno colgante.Encienda el controlador de microinyección y pulse mostrar todos los canales para acceder a la pantalla de comandos. A continuación, presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 9, 800 nanolitros con una tasa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Luego presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione ejecutar para infundir 9, 800 nanolitros de agua destilada del tubo de polietileno conectado a la jeringa de microlitros.Ahora, coloque el inyector en un vial que contenga el aceite mineral, presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 3, 000 nanolitros con una tasa de entrega de 100 nanolitros por segundo. Para retirar 3, 000 nanolitros de aceite mineral, presione la dirección para cambiar al modo de extracción y luego presione ejecutar. Desmonte el tubo de polietileno de la aguja de la jeringa de microlitros.Para escupir 3, 000 nanolitros de agua destilada de la aguja de la jeringa de microlitros, presione la dirección para cambiar al modo de infusión y presione ejecutar. Luego inserte la jeringa de microlitro nuevamente en el tubo de polietileno. Coloque el inyector en un vial que contenga AGCC.Presione la configuración y establezca el objetivo de volumen en 9, 500 nanolitros con una velocidad de entrega de 100 nanolitros por segundo. Extraiga 9, 500 nanolitros de SCFA presionando la dirección para cambiar al modo de extracción y presione ejecutar. Etiquete la fase de SCFA de aceite para validar si los SCFA se infunden con éxito.Presione la configuración y establezca el objetivo de volumen deseado con una velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo. Presione la dirección para cambiar al modo de infusión. Presione correr para infundir la jeringa de microlitro hacia adelante hasta que el líquido salga por el extremo frontal del inyector comercial antes de insertar el inyector en la cánula para la inyección de AGCC.Después de anestesiar el ratón, inserte el inyector comercial en la cánula de guía comercial. Una vez que el ratón se recupere de la anestesia, colóquelo en una jaula novedosa y déjelo explorar durante 35 minutos libremente. Infundir SCFA utilizando una velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo para un volumen objetivo de 2, 100 nanolitros en los primeros 5 minutos.Luego presione la dirección al modo de infusión y presione ejecutar. Después de las pruebas de comportamiento, retire el inyector comercial de la cánula de la guía comercial. Infundir 2, 100 nanolitros del trazador neutro con la velocidad de entrega de 7 nanolitros por segundo para verificar el sitio de infusión.Obtener una imagen de la señal fluorescente en el sitio de infusión con un microscopio de fluorescencia. Tanto los ratones infundidos con ACSF como los SCFA viajaron en una jaula novedosa durante un total de 35 minutos. No se observaron diferencias en la actividad locomotora en la nueva jaula entre la infusión de AGCC y el ACSF.El tinte fluorescente se detectó en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón cuando se infundió con una cánula guía comercial. Del mismo modo, la infusión a través de la cánula guía de acero inoxidable conduce a la detección de señales en el ventrículo lateral y las regiones circundantes del cerebro del ratón. La combinación de este procedimiento con tecnologías neuronales basadas en circuitos permitirá a los científicos obtener información sobre el control basado en circuitos del cerebro y el comportamiento aportado por los metabolitos intestinales.Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren el papel de la microbiota y los metabolitos en el intrincado eje cerebral intestinal.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este artículo muestra dos métodos muy diferentes de inyección: 1) en el cerebro (intracerebroventricular) y 2) sistémica (intravenosa) para introducir los agentes terapéuticos en el sistema nervioso central de ratones recién nacidos.

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Una inyección intracerebroventricular para analizar la distribución del citomegalovirus murino en el cerebro de un ratón neonatal

Fuente: Liou, C. et al. Administración intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra la inyección intracraneal de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en un ratón que se mueve libremente para estudiar sus efectos sobre el comportamiento mediado por el cerebro. Se inserta una cánula inyectora en una cánula guía implantada en el cerebro del ratón. Después de la recuperación, el ratón se...

Inyección intracraneal de metabolitos microbianos derivados del intestino en un modelo de ratón

Un modelo de ratón de la reconstrucción endoscópica de base de cráneo humano se ha desarrollado que crea una interfaz semipermeable entre el cerebro y la nariz con injertos de mucosa nasal. Este método permite a los investigadores estudiar la entrega al sistema nervioso central de la terapéutica de alto peso molecular que se excluyen de otra manera por la barrera sangre-cerebro cuando se administra sistémicamente.

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El protocolo demuestra un método para recolectar sangre de las venas portas y la vena cava inferior de ratones secuencialmente para evaluar la producción y absorción de metabolitos microbianos intestinales.

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El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

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Este artículo describe: (1) administración oral por gavage de moléculas de prueba a ratones neonatales tan pronto como el DOL 6; y (2) evaluación ex vivo de la función de la barrera epitelial del colon en biopsias desde cachorros DOL 10 hasta destete (DOL 20) mediante la evaluación de la permeabilidad paracelular y transcelular con cámaras de Ussing.

Gavage oral en cachorros de ratón neonatal y evaluación funcional de la integridad de la barrera intestinal usando cámaras de uso

Aprende a administrar metabolitos microbianos intestinales en el cerebro de ratones mediante cánula guía intracerebroventricular. Este protocolo validado permite estudiar el eje intestino-cerebro en animales en movimiento libre.

Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

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