Name: Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a generar esferoides hepáticos humanos autólogos a partir de células mononucleares de sangre periférica para estudios de toxicología, cáncer y descubrimiento de fármacos.

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Los autores están especialmente agradecidos por la asistencia técnica proporcionada por Oksana y John Greenacre. Este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.

Se obtuvo la aprobación ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para realizar estos experimentos y todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de acuerdo con las directrices institucionales.
1. Preparación de células mononucleares (EMN) a partir de sangre periférica humana (PB)
<ol><li>Extraiga 30 ml de sangre de donantes sanos con la ayuda de personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.</li>
	<li>Aislar PBMNCs utilizando medios de gradiente de densidad según el protocolo publicado por Becker-Kojić et al.13. Aísle, mediante pipeteo, la capa de interfase entre el plasma y los medios de gradiente de densidad y utilice solución salina tampón fosfato estéril (PBS) para lavar las células aisladas.</li>
	<li>Use una cámara de conteo y cuente el número de celdas usando métodos estándar.</li>
</ol>2. Desdiferenciación de las MNC tras la activación con glicoproteína humana anclada a GPI
<ol><li>Colocar 6 x 106 células mononucleares en PBS/albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en un tubo de poliestireno (15 mL) e incubar con el anticuerpo específico durante 30 min a 37 °C según Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente y reemplazar PBS / BSA con el medio de Dulbecco modificado de Iscove suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).</li>
	<li>Cultivar las células en tubos de poliestireno de 15 ml en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 8-10 días, como se describe en Becker-Kojić et al.13. El día 5 (D5), agregue 1-2 ml de medio de Iscove suplementado con 10% de FBS a cada tubo de 15 ml.</li>
</ol>3. Clasificación de células desdiferenciadas recién generadas
<ol><li>Centrifugar la suspensión de células cultivadas a temperatura ambiente durante 10 min a 300 x g y aspirar con una pipeta estéril el sobrenadante resultante según Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Resuspender el pellet obtenido por centrifugación en 90 μL de tampón PBS frío (PBS pH 7.2, 0.5 % BSA y 2 mM EDTA) y agregar 10 μL de perlas magnéticas de tamaño nanométrico positivas CD45 e incubar en hielo durante 15 min.</li>
	<li>Lave la suspensión celular con 2 ml de tampón PBS, centrifugarla a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y agregue 500 μL de tampón PBS a las celdas y vuelva a suspenderla completamente.</li>
	<li>Pipetear 500 μL de tampón PBS preenfriado en la columna para lavarlo y colocarlo en el campo magnético utilizando un soporte magnético.</li>
	<li>Lave las células colocadas en la columna, dos veces con 500 μL de tampón PBS y recoja el flujo que contiene células CD45 negativas en el medio de Iscove suplementado con 10% de FBS.</li>
	<li>Utilice una cámara de conteo para determinar el número de células reprogramadas.</li>
</ol>4. Preparación de cubreobjetos de vidrio para la generación de hepatocitos humanos
<ol><li>Separe los cubreobjetos de vidrio (14 mm) e incubarlos en detergente no iónico durante 10 min. Lave los cubreobjetos de vidrio en agua desionizada hasta que no queden burbujas e incubarlos en 1M HCl durante 30 min (adaptado de Marchenko et al.14).</li>
	<li>Lave los cubreobjetos de vidrio con agua desionizada al menos 3 veces y séquelos durante la noche a temperatura ambiente. Cubreobjetos de vidrio secado en autoclave en un recipiente adecuado.</li>
</ol>5. Recubrimiento de placas de cultivo celular con biolaminina para la diferenciación hepática 2D de BD-PSCs
<ol><li>Coloque los cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave con un par de pinzas estériles en placas de 4 pocillos y encienda las luces UV durante 30 minutos para garantizar condiciones estériles.</li>
	<li>Descongele las alícuotas de biolaminina y añada 120 μL de 5 μg/ml de biolaminina a cada cubreobjetos de vidrio. Dejar los cubreobjetos de vidrio recubierto durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar el exceso de biolaminina y añadir 200 μL de medio de diferenciación de hepatocitos como se describe a continuación.</li>
</ol>6. Preparación de medios de diferenciación de hepatocitos
<ol><li>Hacer 500 ml de medio de reemplazo sérico knockout de hepatoblastos (KSR)/dimetilsulfóxido (DMSO) que consiste en 76.4% de DMEM KNOCKOUT (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 0.1% β-mercaptoetanol, 1% de DMSO y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep).</li>
	<li>Preparar 500 ml de medio de maduración de hepatocitos que contenga 1% de L-glutamina, 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato de sodio (HCC) y 1% de pluma/estreptococo.</li>
	<li>Medio alícuota de la cepa y añadir factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y oncostatina M (OSM) frescos a concentraciones finales de 10 ng/ml y/o 20 ng/ml para cada cambio medio. NOTA: La oncostatina M es una citoquina perteneciente al grupo de citoquinas interleucina 6, importante para la hematopoyesis y para el desarrollo hepático.</li>
</ol>7. Cultivo de células hepáticas diferenciadas de BD-PSCs
<ol><li>Coloque 3 x 105 células BD-PSCS en cada pocillo de una placa de 4 pocillos recubierta con biolaminina.</li>
	<li>Colocar las placas de 4 pocillos en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Cultive las células durante 5 días en medio de hepatoblastos KSR/DMSO que apoye la diferenciación endodérmica y cambie el medio cada dos días.</li>
	<li>Cambiar al medio de maduración de hepatocitos el día 5 y cultivar las células durante 7-10 días adicionales en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Cambiar el medio cada 48 h.</li>
</ol>8.3D diferenciación hepática esferoide
<ol><li>Cuente las celdas usando una cámara de conteo.</li>
	<li>Suspensión de celda desdiferenciada BD centrífuga a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células desdiferenciadas de BD en medio KSR/DMSO a 2 x 106 células/ml.</li>
	<li>Pase las células a través de un filtro de células de 40 μm para garantizar una suspensión de una sola célula y eliminar cualquier residuo adicional.</li>
	<li>Cuente las células utilizando una cámara de conteo y prepare un volumen suficiente para cada densidad de siembra de células con el fin de dispensar el volumen requerido por pocillo. Prepare un gradiente con siembra superior de 1 x 106 celdas a una densidad de siembra baja de 4000 celdas.</li>
	<li>Dispensar 100 μL de medio KSR/DMSO en 96 placas de fijación bien baja y añadir 100 μL de dilución de siembra celular.</li>
	<li>Colocar la placa de fijación baja en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 y cultivarlas durante 5 días.</li>
	<li>Cambiar el 50% del medio a partir de los días 3-4 después de la siembra cuando los esferoides estén lo suficientemente compactos.</li>
	<li>El día 5, cambie el medio al medio de maduración de hepatocitos y cultive las células durante 7-10 días adicionales para una mayor maduración. Cambie el medio cada dos días.</li>
</ol>9. Análisis de inmunofluorescencia de cultivos de células hepáticas 2D recién generados
<ol><li>Cultive las células de acuerdo con el método de diferenciación descrito anteriormente durante 4, 8, 15 y 24 días y retire los medios.</li>
	<li>Incubar células con fijador precalentado que consiste en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min. Deseche el fijador y lave las células 2 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Agregue inmediatamente una solución de tritón X-100 al 0,1% y permeabilice las células durante 5 minutos. Lavar 2x con PBS.</li>
	<li>Agregue una solución de bloqueo hecha de PBS y BSA al 5% y colóquela en la placa basculante durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anticuerpos primarios diluidos en tampón de dilución 1% BSA/PBS de la siguiente manera: albúmina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteína (AFP) 1:250, citoqueratina 18 (CK18) 1:50, factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4α) 1:1000 y transtiretina (TTR) 1:50. Use 50 μL de dilución de anticuerpos por pocillo.</li>
	<li>Incubar las celdas durante 1 h a temperatura ambiente. Luego deseche la solución de anticuerpos, lave las células durante 5 minutos y repita el paso de lavado 3x.</li>
	<li>Prepare los siguientes anticuerpos secundarios en tampón de dilución: conejo anti-pollo IgG (rojo de Texas) 1:1000, cabra anti-ratón IgG (488) 1:1000 y cabra anti-conejo (488) 1:500. Use 50 μL de dilución de anticuerpos por pocillo e incube las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las celdas 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una y monte los cubreobjetos con medios de montaje que contengan DAPI para análisis microscópico.</li>
</ol>10. Tinción viva de esferoides hepáticos recién formados
<ol><li>Deseche cuidadosamente los medios de cultivo sin tocar los esferoides, agregue PBS recién hecho con solución de tritón X-100 al 0,1% e incube durante 5 minutos para permeabilizar las células.</li>
	<li>Lave los esferoides con el medio pipeteando lentamente durante 5 minutos, repita 2x.</li>
	<li>Incubar los esferoides con los anticuerpos primarios ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) y CYP3A4 (1:200) preparados en PBS con BSA al 1% durante 1 h en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Use 50 μL de dilución de anticuerpos por pocillo.</li>
	<li>Retire con cuidado el exceso de solución de anticuerpos y lave los esferoides con medio 3x.</li>
	<li>Preparar los anticuerpos secundarios correspondientes cabra anti-ratón IgG (Cy3), cabra anti-ratón IgG (488) y conejo anti-pollo IgG (Texas rojo) en una dilución de 1:1000 y 1:500 para cabra anti-conejo (488) en PBS en 1% BSA. Utilizar 50 μL de dilución de anticuerpos por pocillo e incubar durante 20 min en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Lavar cuidadosamente 3x con medio y dejar la placa durante 30 min en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 antes de realizar la microscopía de fluorescencia.</li>
</ol>11. Examen de esferoides utilizando un microscopio de fluorescencia
<ol><li>Encienda la fuente de luz de fluorescencia 10 minutos antes de usar, encienda la computadora y abra el software de imágenes.</li>
	<li>Use un objetivo con un aumento de 4x, haga clic en el botón 4x en la barra de herramientas para seleccionar la barra de escala correcta, luego coloque la placa de 96 pocillos en la placa central del escenario.</li>
	<li>Encienda la fuente de luz LED, use el filtro de campo claro y coloque la placa en el pozo de interés utilizando la perilla de ajuste de la etapa del eje x.</li>
	<li>Cambie a la trayectoria de la luz de la cámara, haga clic en el botón Live in imaging software para visualizar la imagen en la pantalla y asegúrese de que el esferoide esté centrado usando las perillas del eje x y enfoque usando la perilla de enfoque grueso / fino. NOTA: La forma de los esferoides permanece constante después de aplicar tinción viva.</li>
	<li>Elija el método Brightfield Observation en la barra de herramientas, ponga la configuración de exposición en automático y haga clic en el botón Instantánea en el panel de control de la cámara para tomar una foto. A continuación, guarde la imagen como archivo .vsi utilizando el nombre apropiado en la carpeta de interés.</li>
	<li>Coloque la placa de protección de luz ambiental para apagar la luz LED, cambie al filtro para la excitación B, elija el método de observación 488 en la barra de herramientas, abra el obturador, tome una foto haciendo clic en el botón Instantánea, cierre el obturador y luego guarde el archivo como se describe anteriormente.</li>
	<li>Repita esto con un filtro para la excitación G utilizando el método de observación apropiado (rojo de Texas o CY3). Luego reitere todo el procedimiento para cada pozo de interés.</li>
	<li>Devolver la placa a la incubadora deCO2 al 5% a 37 °C y cultivarla como se ha descrito anteriormente.</li>
</ol>

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</ol>

La autora correspondiente declara que es titular de una patente relacionada con la nueva proteína humana ligada a GPI. Es cofundadora y trabaja con ACA CELL Biotech GmbH. Los otros autores declaran que no hay conflictos de intereses.

El hígado es un órgano importante en el cuerpo humano con muchas funciones biológicas esenciales, como la desintoxicación de metabolitos. Debido a fallas hepáticas graves como cirrosis y / o hepatitis viral, hay casi 2 millones de muertes por año en todo el mundo. Los trasplantes de hígado ocupan el segundo lugar en trasplantes de órganos sólidos en todo el mundo, pero solo alrededor del 10% de la necesidad actual se satisface22.
Los hepatocitos humanos primarios (PHH) ...

En los últimos años, los sistemas de cultivo de esferoides tridimensionales (3D) se han convertido en una herramienta importante para estudiar diversas áreas de la investigación del cáncer, el descubrimiento de fármacos y la toxicología. Tales cultivos despiertan gran interés porque cierran la brecha entre las monocapas de cultivo celular bidimensionales (2D) y los órganos complejos1.
En ausencia de una superficie adhesiva, en comparación con el cultivo celular 2D, la formación de esferoides se basa en la afinidad natural de estas células para agruparse en forma 3D. Estas células se organizan en grupos que consisten en uno o más tipos de células maduras. Libre de materiales extraños, estas células interactúan entre sí como en su microambiente original. Las células en cultivo 3D están mucho más cerca y tienen una orientación adecuada entre sí, con mayor producción de matriz extracelular que los cultivos 2D, y constituyen un entorno cercano al natural 2.
Los modelos animales se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la biología humana y las enfermedades3. En este sentido, existen diferencias intrínsecas entre humanos y animales, lo que hace que estos modelos no sean del todo adecuados para estudios extrapolativos. Los esferoides y organoides de cultivo 3D representan una herramienta prometedora para estudiar la arquitectura, la interacción y la diafonía similares a los tejidos entre diferentes tipos de células que ocurren in vivo y pueden contribuir a reducir o incluso reemplazar los modelos animales. Son de particular interés para el estudio de la patogénesis de las enfermedades hepáticas, así como las plataformas de detección de drogas4.
El cultivo de esferoides 3D es de particular importancia para la investigación del cáncer, ya que puede eliminar la discontinuidad entre las células y su entorno al reducir la necesidad de tripsinización o tratamiento con colagenasa necesarios para preparar las monocapas de células tumorales para cultivos 2D. Los esferoides tumorales permiten el estudio de cómo las células normales versus malignas reciben y responden a las señales de su entorno5 y son una parte importante de los estudios de biología tumoral.
En comparación con la monocapa, los cultivos 3D que consisten en varios tipos de células se asemejan a los tejidos tumorales en sus propiedades estructurales y funcionales y, por lo tanto, son adecuados para estudiar la metástasis y la invasión de células tumorales. Es por eso que tales modelos esferoides están contribuyendo a acelerar la investigación del cáncer6.
Los esferoides también están ayudando a desarrollar la tecnología para crear organoides humanos porque la biología de tejidos y órganos es muy difícil de estudiar, particularmente en humanos. El progreso en el cultivo de células madre permite desarrollar cultivos 3D como organoides que consisten en células madre y progenitores tisulares, así como diferentes tipos de células maduras (tejidos) de un órgano con algunas características funcionales como un órgano real que puede usarse para modelar el desarrollo de órganos, enfermedades, pero también pueden considerarse útiles en medicina regenerativa7.
Los hepatocitos humanos primarios se utilizan generalmente para estudiar la biología in vitro de los hepatocitos humanos, la función hepática y la toxicidad inducida por fármacos. Los cultivos de hepatocitos humanos tienen dos inconvenientes principales, en primer lugar, la disponibilidad limitada de tejido primario como los hepatocitos humanos, y en segundo lugar, la tendencia de los hepatocitos a desdiferenciarse rápidamente en el cultivo 2D, perdiendo así su función hepatocitos específica8. Los cultivos hepáticos 3D son superiores en este sentido y recientemente se han realizado a partir de células madre embrionarias humanas diferenciadas (hESCs) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs)9. Los esferoides 3D hepáticos de bioingeniería son de particular interés para estudiar el desarrollo, la toxicidad, las enfermedades genéticas e infecciosas del hígado, así como en el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de enfermedades hepáticas10. Por último, también tienen el potencial de ser utilizados clínicamente, sabiendo que las enfermedades hepáticas agudas tienen una tasa de mortalidad de casi el 80%, los esferoides hepáticos y/o hepáticos bioartificiales podrían rescatar a estos pacientes al proporcionar una función hepática parcial hasta que se pueda encontrar un donante adecuado11.
Hemos establecido un protocolo para la generación de esferoides hepáticos humanos utilizando células madre pluripotentes derivadas de sangre (BD-PSCs) para preparar esferoides de diferentes tamaños que contienen 4000 a 1 x 106 células y analizarlos mediante microscopía óptica e inmunofluorescencia. También probamos la capacidad de la función específica de los hepatocitos, evaluando la expresión de las enzimas citocromo P450 3A4 (CYP3A4) y 2E1 (CYP2E1) que pertenecen a la familia del citocromo P450 que tienen papeles importantes en el metabolismo celular y farmacológico a través del proceso de desintoxicación12.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo de albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>producido en pollo</td></tr><tr><td>Fracción V de albúmina</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-1 Fetoproteína</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>conejo policlonal IgG</td></tr><tr><td>Biolaminina 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>humano recombinante</td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>perlas magnéticas de tamaño nanométrico</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Software de imagen</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 pocillo</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergente disponible en el mercado</td><td>Procter & Gamble</td><td></td><td>detergente no iónico</td></tr><tr><td>anticuerpo específico CYP2E1</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>anticuerpo policlonal de conejo IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>anticuerpo monoclonal de ratón IgG1</td></tr><tr><td>Citoqueratina 18</td><td>DakoCitomatación</td><td>M7010</td><td>anticuerpo monoclonal de ratón IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Descatalogado. Disponible en: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Cubrecristales 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Glutaraldehído 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-ratón IgG Cy3</td><td>en línea</td><td>ABIN1673767</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>IgG antiratón en cabra DyLight 488</td><td>Anticuerpos en línea</td><td>ABIN1889284</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>medio de maduración de hepatocitos</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>anticuerpo humano recombinante</td></tr><tr><td>HNF4&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>clon 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato (sal de sodio)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific 12660012</td><td></td><td>Descontinuado. Disponible en el catálogo No. 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>soporte magnético</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific 11140035</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Columnas MiniMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multiplatos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>Placas de 4 pocillos</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>humano recombinante</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich 158127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS Tubos de 15 ml estériles</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-pollo IgG Texas red</td><td>Anticuerpos en línea</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 humano</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de transtiretina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>producido en pollo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Las células hepáticas humanas pueden formar una estructura tridimensional (3D) capaz de crecer en cultivo durante algunas semanas, preservando su capacidad funcional. Debido a su naturaleza para agruparse en las placas de cultivo con características adhesivas bajas o nulas, forman agregados de múltiples células hepáticas que se denominan esferoides hepáticos humanos. La formación de esferoides hepáticos 3D se basa en la tendencia natural de las células hepáticas a agregarse en ausencia de un sustrato adhesivo. Estas estructuras 3D poseen mejores respuestas fisiológicas que las células, que están más cerca de un entorno in vivo . El uso de cultivos de hepatocitos 3D tiene numerosas ventajas en comparación con los cultivos bidimensionales clásicos (2D), incluido un microambiente biológicamente más relevante, morfología arquitectónica que reensambla órganos naturales, así como una mejor predicción sobre el estado de la enfermedad y las respuestas in vivo a los medicamentos. Se pueden utilizar varias fuentes para generar esferoides, como tejido hepático primario o líneas celulares inmortalizadas. El tejido hepático 3D también se puede diseñar mediante el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) para derivar hepatocitos. Hemos obtenido esferoides hepáticos humanos utilizando células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSC) generadas a partir de sangre periférica no manipulada mediante la activación de proteínas ligadas a GPI unidas a la membrana humana y diferenciadas a hepatocitos humanos. Las células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs y los esferoides hepáticos humanos se analizaron mediante microscopía óptica e inmunofenotipado utilizando marcadores de hepatocitos humanos.

Diferenciamos con éxito las BD-PSC humanas en células progenitoras endodermas / hepáticas y hepatocitos mediante la aplicación de un protocolo de dos pasos. Los cambios morfológicos durante el proceso de diferenciación hepática se muestran en la Figura 1. Las BD-PSC se diferencian en hepatocitos que pasan por tres etapas diferentes. La primera etapa representa la diferenciación en células endodérmicas L4, la segunda, la diferenciación a células progenitoras hepáticas (hepatoblastos) L8, exhi...

Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

La generación de esferoides hepáticos humanos utilizando fuentes autólogas puede contribuir a diversas áreas de investigación como toxicología, cáncer y descubrimiento de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es utilizar hepatocitos humanos derivados de BDPC para diseñar esferoides hepáticos humanos, evitando la escasez de hepatocitos humanos primarios o PHH. Los esferoides humanos autólogos pueden extenderse a la medicina regenerativa y la terapia, especialmente en pacientes con insuficiencia hepática aguda.Anne-Katherin Schott, líder del proyecto en mi laboratorio. Comience preparando 500 mililitros de hepatoblastos KnockOut suero de reemplazo dimetilsulfóxido o KSR DMSO medio y medio de maduración de hepatocitos. Alícuota el medio de la cepa y añadir el factor de crecimiento de hepatocitos fresco o HGF y la oncostatina M u OCM a concentraciones finales de 10 o 20 nanogramos por mililitro para cada cambio de medio.Transfiera tres veces 10 a la quinta células madre pluripotentes derivadas de la sangre o células BD-PSC a una placa de cuatro pocillos recubierta de biolaminina e incube la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco días. Para apoyar la diferenciación endodérmica, cultive las células durante cinco días en medio de hepatoblastos KSR DMSO y cambie el medio cada 48 horas. En el quinto día, agregue el medio de maduración de hepatocitos y cultive las células durante siete a 10 días adicionales en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, asegurando el cambio del medio cada 48 horas.Contar células utilizando una cámara de conteo y centrifugar BD suspensión celular desdiferenciada a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el sobrenadante, resuspender las células BD desdiferenciadas en medio KSR DMSO a dos veces 10 de las seis células por mililitro de concentración. Después de asegurar la suspensión de una sola célula, retire cualquier residuo adicional pasando las células a través de un filtro celular de 40 micrómetros.Una vez más, cuente las células usando una cámara de conteo y prepare un volumen suficiente de cada densidad de siembra celular para dispensar el volumen requerido por pocillo. Prepare un gradiente con siembra superior de un millón de celdas a una densidad de siembra baja de 4, 000 celdas. A continuación, dispense 100 microlitros de medio KSR DMSO en placas de fijación baja de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de dilución de siembra celular.Incubar la placa de fijación baja durante cinco días. Cambiar el 50% del medio al tercer o cuarto día después de la siembra cuando los esferoides estén suficientemente compactos. En el quinto día, cambie el medio a medio de maduración de hepatocitos y cultive las células en él durante siete a 10 días adicionales, cambiando el medio cada 48 horas.Después de cultivar las células durante 4, 8, 15 y 24 días utilizando el método de diferenciación descrito anteriormente, retire el medio. Incubar las células con fijadores precalentados que contengan 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos. Luego, deseche el fijador y lave las células con PBS dos veces durante cinco minutos cada una.Agregue inmediatamente una solución de Triton X-100 al 0,1% y permeabilice las células durante cinco minutos antes de dos lavados de PBS. Agregue una solución de bloqueo hecha de PBS y albúmina sérica bovina al 5% o BSA antes de colocar las células en una placa basculante durante una hora a temperatura ambiente. Diluir anticuerpos primarios en tampón de dilución 1% BSA PBS y añadir 50 microlitros de dilución de anticuerpos por pocillo.Deseche la solución de anticuerpos después de una incubación de una hora a temperatura ambiente y dé tres lavados de cinco minutos cada uno usando PBS. Agregue 50 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos en tampón de dilución en cada pocillo e incube las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las celdas tres veces con PBS durante cinco minutos cada una, monte los cubreobjetos con medios de montaje que contengan DAPI para el análisis microscópico.Deseche cuidadosamente los medios de cultivo sin tocar los esferoides y agregue PBS recién preparado con solución Triton X-100 al 0,1% e incube durante cinco minutos para permeabilizar las células. Lave los esferoides dos veces con el medio pipeteando lentamente el medio. A continuación, incubar los esferoides con 50 microlitros de los anticuerpos primarios durante una hora.Una vez hecho esto, retire con cuidado el exceso de solución de anticuerpos y dé tres lavados de medio. Prepare los anticuerpos secundarios correspondientes como cabra anti-ratón IgG Cy3, cabra anti-ratón IgG 488 y conejo anti-pollo IgG Texas Red en PBS con 1% BSA y agregue 50 microlitros de dilución de anticuerpos por pocillo antes de 20 minutos de incubación en la incubadora de dióxido de carbono. Nuevamente, lavar tres veces con el medio antes de 30 minutos de incubación en la incubadora.Encienda la fuente de luz de fluorescencia 10 minutos antes de usar. Encienda la computadora y abra el software de imágenes. Utilice el objetivo de ampliación 4X haciendo clic en el botón 4X de la barra de herramientas para seleccionar la barra de escala correcta.Luego coloque la placa de 96 pocillos en la placa central del escenario. Encienda la fuente de luz LED, use el filtro de campo claro y coloque la placa en el pozo de interés utilizando la perilla de ajuste de la etapa del eje XY. Cambie a la ruta de luz de la cámara y haga clic en el botón en vivo en el software de imágenes para visualizar la imagen en la pantalla.Asegúrese de que el esferoide esté centrado con las perillas del eje XY y enfoque con la perilla de enfoque grueso o fino. A continuación, elija el método de observación de campo claro en la barra de herramientas, ponga la configuración de exposición en automático y haga clic en el botón de instantánea en el panel de control de la cámara para tomar una foto. Luego guarde la imagen como archivo vsi usando el nombre apropiado en la carpeta de interés.Coloque la placa de protección contra la luz ambiental para apagar la luz LED y cambie el filtro para la excitación B. Luego elija el método de observación 488. Abra el obturador, tome una foto haciendo clic en el botón de instantánea y cierre el obturador y guarde el archivo como vsi.Repita el proceso con un filtro para la excitación G para reiterar el proceso para cada pozo de interés. Los cambios morfológicos durante el proceso de diferenciación hepática mostraron que las BD-PSC se diferenciaron en hepatocitos a través de tres etapas. La primera etapa representó la diferenciación en células endodérmicas.La segunda diferenciación en células progenitoras hepáticas exhibe una morfología poligonal típica. Y el tercero, la maduración a los hepatocitos. El análisis de inmunofluorescencia mostró la fuerte expresión de marcadores progenitores hepáticos humanos del endodermo como la alfafetoproteína o APF y la transtiretina o TTR en las células en la primera etapa del proceso de diferenciación hepática en L4 a L8 día.Sin embargo, su expresión disminuyó a los 15 días. La expresión de albúmina o ALB y del factor nuclear de hepatocitos cuatro alfa o HNF4 alfa apareció primero en L4, aumentó a lo largo del tiempo de diferenciación L4 a L15, y alcanzó una expresión fuerte y estable durante el tiempo de maduración L15 a L24. Se observó agregación espontánea de células en placas de baja unión que contenían inducción de hepatocitos o formación de esferoides iniciada por medio de maduración.Se observó una correlación consistente entre el esferoide esteroide y el número variable de células. Los esferoides formados y diferenciados en L14 y vivos teñidos con anticuerpos revelaron la potencial actividad funcional hepática de los esferoides derivados de BD-PSCs. La preparación de células mononucleares para la reprogramación es el paso más importante en este procedimiento.La generación de esferoides hepáticos humanos es el primer paso para crear organoides in vitro versión simplificada del órgano en 3D con micro anatomía similar a la in vivo. Los organoides creados en el laboratorio se utilizan para estudiar la organogénesis, el desarrollo de enfermedades y los nutrientes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para realizar experimentos 3D "hígado-en-un-chip" infección con el virus de la hepatitis B.

"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.

Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Faltan modelos integrales in vitro que recapitulen fielmente la enfermedad humana relevante. El presente estudio presenta la creación y cultivo de esferoides tumorales tridimensionales (3D), una herramienta in vitro fiable para estudiar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular humano.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

La lesión hepática inducida por fármacos (DILI) es una causa importante de fracaso farmacológico. Se ha desarrollado un protocolo para predecir con precisión la responsabilidad DILI de un compuesto utilizando un sistema microfisiológico hepático (MPS). El modelo hepático utiliza el cocultivo de células hepáticas primarias y criterios de valoración traslacionalmente relevantes para evaluar las respuestas celulares al tratamiento.

Sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro

Los organoides revolucionan el modelado personalizado de tejidos para el desarrollo de órganos, el descubrimiento de fármacos y la investigación de enfermedades. La ingeniería de organoides avanza en la creación de intrincados tejidos sintéticos. El objetivo es integrar la morfogénesis, la tecnología de ensamblaje y las biomatrices para avanzar en la ingeniería de tejidos. Este protocolo ayuda a modelar la organogénesis hepática y a establecer directrices para la construcción de tejidos...

Técnicas de cultivo in vitro para modelar la organogénesis del hígado, construir ensamblajes y diseñar tejidos sintéticos utilizando líneas celulares humanas

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

Aprenda a generar esferoides hepáticos humanos autólogos a partir de células mononucleares de sangre periférica para estudios de toxicología, cáncer y descubrimiento de fármacos.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

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