Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo describe nuestra generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes. Esta tecnología se puede utilizar para estudiar aspectos de vasculogénesis, angiogénesis, enfermedad vascular, así como patologías vasculares. La reproducibilidad y la naturaleza de alto rendimiento, así como su consistencia en muchas líneas diferentes de células madre, son grandes ventajas de esta técnica.

En términos de su aplicación, algunas de nuestras investigaciones anteriores describen el uso de organoides de los vasos sanguíneos para estudiar los cambios morfológicos para la vasculatura del paciente diabético y explora las vías de tratamiento farmacológico para la vasculopatía diabética. Mantener adecuadamente la población inicial de células madre, evitar que los agregados se agrupen y garantizar un diámetro agregado casi homogéneo, estos son factores esenciales para generar buenos organoides de vasos sanguíneos. Comenzar la generación de agregados utilizando células madre pluripotentes humanas cultivadas, o hPSCs, con una confluencia del 70%.

Usando una pipeta o un sistema de vacío, aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con un mililitro de reactivo de disociación celular antes de incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Mientras tanto, prepare el volumen necesario de medio de agregación en un tubo cónico de 15 mililitros, siguiendo la formulación mencionada en el texto manuscrito. Después de incubar las células, aspire el reactivo de disociación celular antes de suspender las células en un mililitro de medio de agregación.

Pipetea suavemente el contenido hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de una sola celda. Cuente las células utilizando un dispositivo automatizado de conteo de células o bajo un microscopio, y calcule el número total de células necesarias para la formación de agregados. La lectura de viabilidad celular muestra una suspensión de una sola célula con grupos bajos o nulos.

Aspire el sobrenadante del tubo y agregue el volumen apropiado de la suspensión celular al medio de agregación en el tubo cónico de polipropileno de alta claridad de 15 mililitros y pipete suavemente la suspensión celular diluida hacia arriba y hacia abajo para garantizar una distribución homogénea de la celda. Pipetear tres mililitros de la suspensión celular diluida en cada pocillo deseado de la placa de cultivo de fijación ultra baja de seis pocillos. Coloque la placa en la incubadora y minimice cualquier perturbación para mantener el tamaño y la forma de los agregados.

Prepare los medios del mesodermo como se describe en el texto manuscrito. 24 horas después de la siembra de las células, saque la placa de cultivo de la incubadora. Agite la placa en un movimiento circular para acumular los agregados en el centro de cada pozo.

Con una pipeta de un mililitro, transfiera suavemente los agregados con el medio de cada pocillo al tubo cónico correspondiente. Permita que los agregados sedimenten en los tubos cónicos a temperatura ambiente durante una hora. Una vez sedimentado, aspirar el sobrenadante con una pipeta o una bomba aspiradora de alta sensibilidad con precaución, sin alterar los agregados sedimentados.

Resuspender los agregados en cada tubo añadiendo dos mililitros de medio de inducción de mesodermo. A continuación, transfiera la suspensión de cada tubo al pocillo respectivo de la placa de cultivo de seis pocillos de fijación ultrabaja. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y déjela hasta el cuarto día.

En el cuarto día, saque la placa de cultivo de la incubadora, luego agite la placa con un movimiento circular para recolectar los agregados en el centro de cada pozo. Con una pipeta de un mililitro, transfiera suavemente los agregados con el medio circundante de cada pocillo al tubo cónico correspondiente. Establezca un temporizador durante 30 minutos para permitir que los agregados sedimenten en los tubos.

Una vez sedimentados los áridos, preparar las placas de cultivo como se demostró previamente y colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados hasta el sexto día. Para la incrustación de agregados y la inducción de brotes de vasos, prepare el volumen final deseado de la solución de matriz extracelular mientras trabaja en hielo. Pipetear 500 microlitros del ECM en un pocillo de una placa de 12 pocillos para formar la primera capa del sándwich ECM.

Para garantizar una polimerización efectiva de la primera capa de ECM, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas. Hacia el final de la incubación de dos horas, comience a trabajar con los agregados en la placa de cultivo. Reúna los agregados en el centro de cada pocillo antes de usar una pipeta de un mililitro para transferir suavemente los agregados y el medio de cada pozo a un tubo cónico correspondiente de 15 mililitros.

Deje que los agregados se asienten durante 10 a 15 minutos antes de aspirar el sobrenadante. Después de lo cual, mantenga los tubos cónicos que contienen los agregados en hielo durante cinco minutos. Trabajando rápida y cuidadosamente, resuspender los agregados en 500 microlitros de ECM sin formación de burbujas.

Usando una pipeta, coloque la suspensión de agregado ECM sobre la primera capa ECM ya polimerizada dentro del pozo en la placa de 12 pocillos. Mientras tanto, prepare el medio de germinación como se describe en el texto manuscrito. Después de dos horas de incubación a 37 grados centígrados, agregue un mililitro de medio germinado precalentado a 37 grados centígrados en el pozo para inducir la diferenciación de los vasos sanguíneos.

Trabajando en condiciones estériles, use el extremo redondeado de una espátula estéril para aflojar la matriz de germinación de ECM que contiene las redes vasculares. Luego, usando fórceps estériles y el extremo redondeado de una espátula estéril, transfiera cuidadosamente el disco de gel aflojado a la tapa de una placa de cultivo de 10 centímetros. Coloque el gel en la tapa bajo un microscopio estereoscópico ajustado al aumento y enfoque deseados, y use agujas estériles para cortar las redes de vasos sanguíneos individuales, tratando de limitar la cantidad de ECM no vascularizada obtenida en el proceso.

Transfiera suavemente los organoides aislados a un pocillo de una placa de seis pocillos de fijación ultra baja que contenga tres mililitros de medio de brotación. A continuación, utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera los organoides individuales al número apropiado de pocillos en una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja. Una vez transferido, agregue 200 microlitros de medio de germinación precalentado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.

De cuatro a seis días después del aislamiento en la placa de 96 pocillos, asegúrese de que los organoides posean una morfología redonda y saludable antes de proceder a fijarlos y teñirlos. Las imágenes de la progresión gradual de la generación del organoide de los vasos sanguíneos humanos, o hBVO, a partir de hPSCs se capturaron en campo claro. En el día cero, se generaron agregados de 30 a 100 micras de diámetro a partir del cultivo de hPSC.

Se observaron cambios sutiles en el tamaño y la forma de los agregados en la inducción del mesodermo el primer día, que cambió aún más en el cuarto día cuando los agregados se sometieron a cebado vascular. La brotación temprana del vaso casi radialmente simétrica se puede observar el día siete, un día después de incrustar los agregados en la matriz de brotación. La morfología organoide saludable y la continua brotación de vasos se observaron en el día nueve, que progresó a vasos en etapa tardía que brotaron en el día 10 cuando las estructuras celulares densas en el centro organoide casi desaparecieron.

La morfología típica de los organoides de los vasos sanguíneos humanos maduros se observó claramente en el día 15. La tinción de montaje completo de los hBVO maduros en el día 15 exhibió una red endotelial extensa y conectada que era CD31 positiva y rodeada de parásitos PDGFR-beta positivos y actina de músculo liso alfa positivo para SMA. Las células murales PDGFR-beta-positivas y SMA-positivas que encapsulan las redes de vasos endoteliales están bien observadas.

También se observó una membrana basal continua de colágeno IV positivo que envuelve las redes de vasos. Asegurar una polimerización adecuada de la matriz extracelular durante el paso de incrustación es fundamental para la brotación efectiva de los vasos sanguíneos. Los investigadores han utilizado nuestra tecnología de organoides de vasos sanguíneos para generar compartimentos vasculares tempranos en modelos de organoides ya establecidos, como el cerebro y el riñón, que anteriormente eran avasculares.