Name: Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 29 s
Description: Descubre la síntesis de tiofenosulfonamidas como inhibidores de LuxR/HapR en Vibrio para reducir la patogenicidad bacteriana. Este método integra química orgánica y microbiología para desarrollar terapias sin resistencia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación biológica de las tiofenesulfonamidas en la inhibición de la detección de quórum

<ol><li>Ng, W. L., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+quorum-sensing+network+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Bacterial quorum-sensing network architectures.</a> Annu Rev Genet. 43, 197-222 (2009).</li>
<li>Barrasso, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+quorum-sensing+systems+in+bacterial+pathogens+and+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual-function quorum-sensing systems in bacterial pathogens and symbionts.</a> PLoS Pathog. 16, e1008934(2020).</li>
<li>Ball, A. S., Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+gene+regulation+by+LuxR%2FHapR+master+regulators+in+Vibrios%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing gene regulation by LuxR/HapR master regulators in Vibrios.</a> J Bacteriol. 199 (19), 00105-00117 (2017).</li>
<li>Ramos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TetR+family+of+transcriptional+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The TetR family of transcriptional repressors.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 326-356 (2005).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QStatin%2C+a+selective+inhibitor+of+quorum+sensing+in+Vibrio+species%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">QStatin, a selective inhibitor of quorum sensing in Vibrio species.</a> mBio. 9 (1), 02262(2018).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LuxR+homologue+SmcR+is+essential+for+Vibrio+vulnificus+pathogenesis+and+biofilm+detachment%2C+and+its+expression+is+induced+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">LuxR homologue SmcR is essential for Vibrio vulnificus pathogenesis and biofilm detachment, and its expression is induced by host cells.</a> Infect Immun. 81, 3721-3730 (2013).</li>
<li>Hasegawa, H., Hase, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TetR-type+transcriptional+regulator+VtpR+functions+as+a+global+regulator+in+Vibrio+tubiashii%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TetR-type transcriptional regulator VtpR functions as a global regulator in Vibrio tubiashii.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 7602-7609 (2009).</li>
<li>Dorn, S. K., Newman, J. D., Van Kessel, J. C., Brown, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+assay+of+small-molecule+quorum+sensing+inhibitors%3A+A+three-week+course-based+undergraduate+research+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Educ%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological assay of small-molecule quorum sensing inhibitors: A three-week course-based undergraduate research experience.</a> J Chem Educ. 98, 3533-3541 (2021).</li>
<li>Newman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+divergence+in+the+ligand-binding+pocket+of+Vibrio+LuxR%2FHapR+proteins+determines+the+efficacy+of+thiophenesulfonamide+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amino acid divergence in the ligand-binding pocket of Vibrio LuxR/HapR proteins determines the efficacy of thiophenesulfonamide inhibitors.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1173-1188 (2021).</li>
<li>Mohrig, J. R. H., Schatz, P. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohrig%2C+JRH+%22Techniques+in+Organic+Chemistry.+3.+End%22">Techniques in Organic Chemistry. 3. End</a>. , Freeman and Company. (2001).</li>
<li>Kochnev, Y., Hellemann, E., Cassidy, K. C., Durrant, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Webina%3A+An+open-source+library+and+web+app+that+runs+AutoDock+Vina+entirely+in+the+web+browser%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Webina: An open-source library and web app that runs AutoDock Vina entirely in the web browser.</a> Bioinformatics. 36, 4513-4515 (2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+SmcR%2C+a+quorum-sensing+master+regulator+of+Vibrio+vulnificus%2C+provides+insight+into+its+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of SmcR, a quorum-sensing master regulator of Vibrio vulnificus, provides insight into its regulation of transcription.</a> J Biol Chem. 285, 14020-14030 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+molecular+graphics+system+v.+2.0%22">The PyMOL molecular graphics system v. 2.0</a>. , Schrodinger, LLC. (2023).</li>
<li>PyMol wiki commands. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://pymolwiki.org/index.php/Category:Commands">https://pymolwiki.org/index.php/Category:Commands</a> (2023).</li>
<li>van Kessel, J. C., Ulrich, L. E., Zhulin, I. B., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+activator+and+repressor+functions+reveals+the+requirements+for+transcriptional+control+by+LuxR%2C+the+master+regulator+of+quorum+sensing+in+Vibrio+harveyi%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Analysis of activator and repressor functions reveals the requirements for transcriptional control by LuxR, the master regulator of quorum sensing in Vibrio harveyi.</a> mBio. 4 (4), 00378(2013).</li>
<li>Swenson, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+verification+of+commercially+available+pressure+cookers+for+laboratory+sterilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment and verification of commercially available pressure cookers for laboratory sterilization.</a> PLoS One. 13, e0208769(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cloruro de 2-tiofensulfonilo</td><td>Ambeed</td><td>A258464</td><td></td></tr><tr><td>3-fenil-1H-pirazol</td><td>Ambeed</td><td>A104401</td><td>98%</td></tr><tr><td>96 pocillos Placas negras de fondo transparente USA</td><td>Scientific</td><td>5665-5090Q</td><td>Poliestireno de 96 pocillos uPlaca TC negra transparente con tapa, fondo plano transparente, estéril, 8/funda, 32/caja&nbsp;</td></tr><tr>Herramientas <td></td><td></td> de <td>acoplamiento automático</td><td>http://mgltools.scripps.edu/downloads</td></tr><tr><td>Vina</td><td></td><td></td> de acoplamiento <td>automático https://vina.scripps.edu&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de etilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA31344M4</td><td></td></tr><tr><td>Hexanos</td> de grado reactivo <td>Fisher Scientific</td><td>H291</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Película microporosa</td> anhidra<td>USA Scientific</td><td>2920-1010</td><td>Película microporosa, -20 °C a +80 °C, 50/caja,</td></tr><tr><td>Molview</td><td></td><td></td><td>esterilizado molview.org</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco</td><td></td><td></td> de datos de proteínas <td>https://www.rcsb.org/</td></tr> <tr><td>Pymol</td><td></td><td></td><td>https://pymol.org/2/</td></tr> <tr><td>Papel de filtro cualitativo</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805-342</td><td>Cytiva Whatman&trade; Papel de filtro cualitativo: Círculos de grado 1, 47 mm</td></tr><tr><td>Gel de sílice</td><td>Sorbtech</td><td>30930M-25</td><td>Gel de sílice, grado estándar, 60A, 40-63um (malla de 230 x 400)</td></tr><tr><td>Hidruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>452912</td><td>60 % de dispersión en aceite mineral</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTX02847</td><td>Tetrahidrofurano, anhidro, 99,9%, Grado ACS, DriSolv</td></tr><tr><td>Placas TLC</td><td>Sorbtech</td><td>1634067</td><td>Placas TLC de gel de sílice, con respaldo de aluminio</td></tr><tr><td>Triptona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>webina</td><td></td><td></td><td>https://durrantlab.pitt.edu/webina/</td></tr> <tr><td>Extracto de levadura</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum vibrio

Synthesis and Assay of Vibrio Quorum Sensing Inhibitors

Como resultados representativos, se incluyen datos de tres compuestos de tiofenesulfonamida sintetizados por estudiantes de pregrado para los compuestos 1A, 2B y 3B (Figura 5A-C; descrito en detalle en Newman et al.9). Cada compuesto se probó en la cepa de E. coli que expresa V. campbellii LuxR y utilizando el plásmido reportero pJV064. La fluorescencia normalizada por célula se muestra para cada ensayo. El ensayo se realizó con una serie de diluciones 1:10 para ensayar concentraciones de 1 μM, 10 μM y 100 μM de cada compuesto en comparación con el control con solvente. Los compuestos 1A y 3B fueron inhibidores, aunque en diferentes grados: 1A solo exhibió inhibición de LuxR a 100 μM, como lo demuestra la pérdida de la expresión de GFP y el aumento de la expresión de mCherry. Por el contrario, 3B inhibió la actividad de LuxR en las tres concentraciones probadas. El compuesto 2B no tuvo ninguna actividad; por lo tanto, todas las concentraciones probadas parecían similares a las del control de solvente DMSO. Se recomienda un mínimo de tres réplicas biológicas de cada ensayo para realizar estadísticas y determinar la distribución de los datos y el error.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig01.jpg"> Figura 1: Las proteínas LuxR/HapR son los reguladores QS maestros en Vibrios. (A) Esquema del circuito QS genérico en la especie Vibrio. Los receptores de histidina quinasa unidos a la membrana se unen a los autoinductores, lo que conduce a la producción del regulador transcripcional QS maestro LuxR/HapR. Se activan los comportamientos grupales, que generalmente incluyen numerosos factores de virulencia que contribuyen a la enfermedad por vibriosis. Los inhibidores de la tiofenesulfonamida, como el compuesto PTSP (3-phenil-1-(thiophen-2-ilsulfonil)-1 H-pyrazol) se unen a LuxR/HapR y bloquean su función, eliminando así los comportamientos grupales. (B) Representación de pymol de una estructura acoplada: proteína SmcR de V. vulnificus en la que PTSP se ha modelado en el bolsillo de unión utilizando Webina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig02.jpg"> Figura 2: Síntesis de tiofenesulfonamidas. (A) Esquema general para la síntesis de compuestos de tiofenesulfonamida. (B) Esquema para la síntesis de PTSP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig03.jpg"> Figura 3: Modelado de PTSP en SmcR. (A) Salida de Webina que muestra PTSP acoplado en el bolsillo de unión al ligando de SmcR de Vibrio vulnificus. (B) Una figura de un informe de un estudiante que muestra una representación Pymol de la misma interacción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig04.jpg"> Figura 4: Cribado de E. coli para inhibidores de tiofenesulfonamida de LuxR/HapR. (A) Diagrama del plásmido indicador de pantalla rojo-verde de E. coli y el plásmido de expresión de LuxR/HapR. (B) Diagrama de la configuración de la placa de ensayo de 96 pocillos para el cribado de compuestos de tiofenesulfonamida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig05.jpg"> Figura 5: Datos de los estudiantes evaluando tres tiofenesulfonamidas en el ensayo de E. coli. Se sintetizaron y ensayaron tres compuestos (A-C) como se describe en este protocolo. La fluorescencia normalizada de GFP y mCherry se muestra para los tres compuestos en comparación con el control de solvente DMSO a igual volumen. Estos datos provienen de un único ensayo biológico para cada compuesto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66582/66582fig07.jpg"> Figura 6: Inhibidores moderados de LuxR con motivos estructurales inexplorados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/66582fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Programa de dos semestres del laboratorio ASURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66582/supplemental%20figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio

Bacteria detect local population numbers using quorum sensing, a method of cell-cell communication broadly utilized to control bacterial behaviors. In ...

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Investigación

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Biology

Biología

Fuente: Speare, L., et al. Ensayo de coincubación para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un ensayo de coincubación utilizado para estudiar cómo compiten las cepas bacterianas en un entorno compartido. Se aplica ampliamente en microbiología para identificar mecanismos, como la muerte dependiente o independiente del contacto, que impulsan estas interacciones.

Ensayo de coincubación para estudiar interacciones competitivas entre cepas bacterianas

La detección y el aislamiento de especies de Vibrio clínicamente relevantes requieren medios de cultivo selectivos y diferenciales. Este estudio evaluó la capacidad de un nuevo medio cromogénico para detectar e identificar V. parahaemolyticus y otras especies relacionadas. Se encontró que el nuevo medio tenía mejor sensibilidad y especificidad que el medio convencional.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Este manuscrito describe un método para utilizar la microscopía de fluorescencia unicelular para visualizar y cuantificar la competencia bacteriana en el cocultivo.

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El objetivo de este protocolo es cuantificar la producción de violaceína por Chromobacterium violaceum ATCC 12472 como un proxy para evaluar la inhibición de la detección de quórum por compuestos bioactivos.

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La reacción de Ugi ha demostrado ser una manera conveniente de crear rápidamente diversas bibliotecas de compuestos. Se trata de la reacción de una amina, aldehído, un ácido carboxílico y un isonitrilo normalmente en metanol a temperatura ambiente. En este video, nosotros utilizamos un 48 ranura Mettler-Toledo MiniBlock equipados con tubos de filtración y un manejador de Mettler-Toledo MiniMapper líquido automatizado fue utilizado para entregar los reactivos y disolventes. Los parámetros de...

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La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios.

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