Monitorización de la acumulación de nanofármacos en metástasis de cáncer de mama murino

Nuestra investigación se centra en el tratamiento de las metástasis del cáncer de mama mediante terapias guiadas por imágenes en una plataforma de nanopartículas de óxido de hierro. El objetivo es desarrollar terapias efectivas dirigidas específicamente a los tejidos metastásicos, que son las principales causas de muerte relacionada con el cáncer. Puede ser difícil determinar si las terapias sistémicas han alcanzado el tejido deseado sin sacrificar a los animales.

Nuestra nanopartícula se puede visualizar mediante técnicas de resonancia magnética e imágenes ópticas, lo que nos permite controlar la administración y acumulación de fármacos en animales vivos. Las terapias actuales para el cáncer de mama metastásico no son específicas para las metástasis, tienen una eficacia variable y causan efectos secundarios indeseables. Nuestra plataforma de nanopartículas se dirige específicamente al nicho metastásico y permite un seguimiento no invasivo de su administración sin evidencia de efectos adversos.

Anteriormente, utilizamos nuestra plataforma de nanopartículas para dirigirnos a un impulsor de la metástasis, miR-10b, y pudimos detener la metástasis y el crecimiento de las metástasis. Con la vista puesta en la traslación clínica, estamos investigando la farmacodinámica de esta formulación para optimizar el régimen de tratamiento y maximizar la eficacia. Para comenzar, coloque el Matrigel congelado a 4 grados centígrados durante 24 horas para permitir que el extracto de la matriz se licúe.

Después de determinar el número total de células necesarias para el estudio, tripsinícelas y lávelas con PBS. Centrifugar las células a 200 g durante 5 minutos. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS refrigerado para crear el stock de celdas.

Ahora, diluye el número total de celdas a 40 por 10 a la potencia de 6 celdas por mililitro. A continuación, añada un volumen igual del extracto de matriz enfriada para conseguir una concentración final de 1 por 10 a la potencia de 6 células por cada 50 microlitros. Mantenga la mezcla en hielo para evitar que el extracto se solidifique antes de la implantación.

Transfiera el ratón anestesiado a un cono de nariz en una almohadilla térmica. Después de confirmar el plano quirúrgico de la anestesia, aplique ungüento oftálmico para proteger los ojos de la sequedad de la córnea. A continuación, limpie la piel cerca del lugar de la inyección con una toallita con alcohol y deje que se seque durante unos segundos.

Inducir en la glándula mamaria número cuatro para minimizar la superposición de señales entre el tumor primario y los sitios de metástasis comunes. Ahora, pipetee el stock de células hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender las células. Extraiga 50 microlitros de la suspensión de células heladas en una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29.

Inserte el bisel de la aguja directamente debajo del pezón de la glándula mamaria deseada, paralelo al cuerpo del ratón, e inyecte las células a un ritmo constante y lento. Deje la aguja en la piel durante al menos 5 segundos después de completar la inyección para permitir que el Matrigel se solidifique y evite fugas. Después, mueva el ratón a una jaula limpia en una almohadilla térmica para su recuperación y supervise hasta que esté completamente ambulatorio y pueda mantener la decúbito esternal.

Para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de metástasis, inyecte 150 miligramos por kilogramo de peso corporal de luciferina intraperitoneal en el modelo de ratón de cáncer de mama metastásico anestesiado. Regrese a los ratones a su jaula en una almohadilla térmica para permitirles despertar y metabolizar la luciferina. A continuación, tome imágenes de los ratones utilizando el escáner del sistema de imágenes, comenzando aproximadamente 10 minutos después de la inyección con luciferina.

Visualice hasta 5 ratones juntos en posición supina, asegurándose de que todo su cuerpo esté incluido dentro de las marcas de la guía del campo de visión y orientado lo más recto posible. Use cinta adhesiva transparente para asegurar sus brazos y visualizar mejor los ganglios linfáticos axilares. Ahora, en el software del sistema de imágenes, establezca la Exposición en Automático, la Agrupación en Media, FStop en 1, la Excitación en Bloqueo, la Emisión en Abierta, el FOV en D y la Altura en 1,50 para imágenes de bioluminiscencia.

Al obtener imágenes del tumor primario, que normalmente produce una señal fuerte debido a su ubicación superficial, establezca la exposición en Automático. Si está monitoreando metástasis, cubra cuidadosamente el tumor primario con cinta aislante negra y configure manualmente la exposición en 300 segundos para capturar cualquier señal débil. Para empezar, pesa a los ratones con cáncer de mama metastásico, ya que la dosis del nanofármaco se basa en el peso corporal.

Prepare una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 llena de 10 miligramos de nanofármaco de hierro por kilogramo de peso corporal del ratón. Luego sumerja la cola del animal anestesiado en agua tibia a 30 a 35 grados centígrados durante 30 segundos para dilatar las venas de la cola. Después de eso, limpie el exceso de agua de la cola y limpie el lugar de la inyección con una toallita con alcohol al 70%.

Ahora, inserte el bisel de la aguja en la vena lateral de la cola aproximadamente a la mitad de la cola. Tire ligeramente hacia atrás del émbolo para confirmar la colocación con el retroceso de la sangre en la aguja. Una vez realizada la inserción con éxito, inyecte el nanofármaco de forma constante a un ritmo lento de aproximadamente 5 a 10 segundos para una inyección de 40 microlitros.

Confirme el éxito de la inyección por la falta de solución que se acumula debajo de la piel de la cola cerca del lugar de la inyección, y por el oscurecimiento de la vena de la solución de nanopartículas oscuras. Mantenga la presión sobre el sitio de la inyección con una gasa y retire la aguja. Mantenga la presión durante aproximadamente 30 segundos hasta que se detenga el sangrado.

Para recolectar muestras de metástasis, comience por obtener imágenes de los ratones mediante imágenes de bioluminiscencia. Después de recolectar las metástasis, coloque los tejidos recolectados en una placa de Petri. En el software del sistema de imágenes, establezca la Exposición en Automática, la Agrupación en Media, FStop en 1, la Excitación en Bloqueo, la Emisión en Abierta, el FOV en D y la Altura en 1,50 para las imágenes de bioluminiscencia.

Para imágenes de fluorescencia, establezca Exposición en Automático, Binning en Medio, FStop en 1, Excitación en 675, Emisión en 720, Nivel de la lámpara en Alto, FOV en D, Altura en 1.50. A continuación, obtenga una imagen del cadáver del ratón con BLI para determinar si queda algún tejido canceroso que valga la pena recolectar. A continuación, enjuague los tejidos cancerosos recolectados en PBS.

Para recolectar tejidos para microscopía o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa, insértelos en un compuesto de temperatura de corte óptima y guárdelos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para el procesamiento. Para recolectar tejidos para la espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente, tara una escala utilizando un tubo vacío de 1,7 mililitros. Coloque el pañuelo en el tubo y registre su peso.

Después de congelar el pañuelo, guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para procesar. Criosección: la temperatura óptima de corte, incrustó muestras frescas congeladas en portaobjetos de microscopía de 10 micrómetros de espesor. Ajuste las temperaturas de la cámara y del portamuestras entre menos 20 grados Celsius y menos 15 grados Celsius, según el tipo de tejido.

Fije las secciones de tejido en los portaobjetos sumergiéndolos en una solución de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Enjuague cuidadosamente los portaobjetos con PBS. A continuación, monte los portaobjetos de la cubierta en los portaobjetos utilizando un medio que contenga DAPI para visualizar la arquitectura del tejido.

Utilice un microscopio de fluorescencia para examinar las secciones de tejido en busca de fluorescencia Cy5.5, lo que indica la administración de nanofármacos. Confirme que la señal de fluorescencia no es ruido de fondo comparándola con una muestra de control negativa de un animal no inyectado. Los ratones tratados con Nanodrug mostraron señales bioluminiscentes significativas en las metástasis pulmonares una semana después de la administración, lo que confirma la presencia de metástasis en los tejidos pulmonares.

Las imágenes de fluorescencia confirmaron la acumulación de Cy5.5 del nanofármaco solo en los tejidos pulmonares metastásicos de los ratones tratados.