Name: Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a evaluar la deposición de hierro en cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB. Este protocolo histoquímico permite detectar y cuantificar acumulación de hierro en modelos de Alzheimer.

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<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
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La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común y se ha convertido en un grave problema para la sociedad. La prevalencia de la EA aumenta drásticamente con la edad 1,2,3,4. Las principales características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA) incluyen la deposición de placas de β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares (NFT) debido a la fosforilación aberrante de las proteínas tau. Aβ se genera a través de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por las enzimas β-secretasa y γ-secretasa. La desregulación en la producción o eliminación de Aβ conduce a su acumulación en el cerebro, formando placas amiloides, que se reconocen como uno de los marcadores patológicos más tempranos de la EA. Estas placas no solo causan daño neuronal directo, sino que también inician una cascada de efectos perjudiciales, como la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la disfunción sináptica. En conjunto, estos procesos contribuyen a la muerte neuronal y al deterioro cognitivo progresivo observado en la EA5. A pesar de décadas de investigación dirigida principalmente a las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA), incluida la deposición de placa de β amiloide y la agregación de proteína tau hiperfosforilada, los avances terapéuticos clínicamente significativos siguen siendo difíciles de alcanzar, y las intervenciones existentes demuestran una eficacia limitada para modificar la progresión de la enfermedad6.
El hierro es un metal importante para mantener la función cerebral y está involucrado en el transporte de oxígeno, la síntesis de ADN, la respiración mitocondrial, la síntesis de mielina, la síntesis de neurotransmisores y el metabolismo. Sin embargo, el hierro se vuelve dañino cuando las concentraciones exceden la capacidad de secuestro celular 6,7,8. Se ha observado un aumento de la deposición de hierro, generalmente colocalizada con placas Aβ, tanto en las regiones cortical como en el hipocampo del cerebro en pacientes con EA 9,10. A través de la reacción de Fenton11, el hierro libre intracelular puede generar radicales hidroxilo (-OH), así como especies reactivas de oxígeno. Estas sustancias nocivas no solo inducen neuroinflamación al activar las células gliales, sino que también atacan las biomoléculas de la célula a través del estrés oxidativo, interrumpiendo la función celular normal y provocando disfunción sináptica 8,12. Además, el aumento del hierro está directamente implicado en el desarrollo de signos patológicos de la EA: el hierro contribuye a la producción de Aβ12 y también aumenta la disfunción de la proteína tau, lo que conduce a ovillos neurofibrilares13.
Se han desarrollado varias técnicas para evaluar el contenido de hierro en el cerebro, incluyendo la resonancia magnética (RM), así como métodos químicos e histoquímicos14. La cuantificación in vivo de los niveles de hierro intracerebral mediante resonancia magnética es clínicamente importante para los pacientes con envejecimiento y neurodegeneración15. La resonancia magnética tiene la ventaja de ser no invasiva y muy sensible: puede detectar la deposición de hierro en las primeras etapas de la enfermedad. En particular, la técnica de aumento de R2 dependiente del campo (FDRI) puede distinguir entre diferentes formas de hierro, como el hierro ferritina y el hierro hemo16. Sin embargo, la resonancia magnética no puede detectar la acumulación de hierro a nivel celular y es costosa, por lo que se utiliza principalmente en investigaciones clínicas17.
La medición colorimétrica es un método químico que determina la concentración de una sustancia (como el hierro) midiendo la intensidad del color producido por la reacción de la sustancia en solución con un agente cromogénico18. Este método es fácil de realizar y utiliza reactivos e instrumentación de bajo costo, lo que lo hace adecuado para laboratorios con presupuestos limitados18. Sin embargo, la precisión y la sensibilidad de este método son muy limitadas, ya que los resultados están sujetos a la influencia de factores ambientales, el tiempo de desarrollo del color y el juicio subjetivo del operador. La espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS) es otro método que se puede utilizar para evaluar los niveles de hierro19. En este método, se obtiene una solución de muestra clarificada quemando el tejido de interés en un horno de alta temperatura. A continuación, la muestra se disuelve utilizando ácido clorhídrico y la concentración de hierro en la solución se determina mediante espectrometría de absorción atómica. Este método es altamente sensible y adecuado para todo tipo de muestras biológicas19. Sin embargo, el proceso lleva mucho tiempo y requiere equipos costosos, por lo que su uso es limitado.
La tinción de Perls/DAB para detectar hierro férrico no hemo es el método de detección de hierro más utilizado debido a su alta especificidad y facilidad de implementación en comparación con otros métodos histoquímicos14. A diferencia del análisis colorimétrico, la tinción de Perls es un método de tinción histoquímica cualitativa que se basa en la reacción entre los iones de hierro y el ferrocianuro de potasio para generar un precipitado azul. Se utiliza para visualizar microscópicamente la presencia y distribución de hierro en los tejidos. Además, este método nos permite distinguir la deposición de hierro en diferentes tipos de células y observar la distribución subcelular de la deposición de hierro, proporcionando un método para el estudio de la AD20. La tinción de Perls detecta principalmente el hierro férrico no hemo y depende de la formación del complejo azul de Prusia:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;">
(Azul de Prusia)
Sin embargo, la tinción tradicional de Perls es ineficaz para detectar la localización del hierro a niveles bajos de hierro. Cuando se añade diaminobenzidina (DAB), reacciona con el hexacianoferrato férrico para formar un compuesto marrón, aumentando la especificidad del ensayo21.
El objetivo de este protocolo es describir cómo evaluar la cantidad y distribución de la deposición de hierro en el cerebro de un modelo de ratón con EA. En este protocolo, se utilizaron ratones transgénicos 5×FAD (C57BL/6J) de 8 meses de edad como modelo de ratón AD y se compararon con ratones de tipo salvaje de la misma edad. Aquí se presentan los detalles de los procedimientos para preparar el reactivo químico, seccionar el cerebro, realizar la tinción de Perls/DAB y analizar las imágenes tomadas después de la tinción.

<table><tbody><tr><td>0.1 M PBS</td><td>biosharp</td><td>BL601A</td><td>Agregue agua desionizada para hacer la solución</td></tr><tr><td>4% PFA &nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>Restaurar a 4 & grados; C para el uso</td></tr><tr><td>de la solución 20X DAB</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu; l solución A, 10 &mu; l solución B y 180 &mu; l PBS</td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td>Agregue agua destilada a 50 ml</td></tr> de <tr><td>ketamina &nbsp;</td><td>China National Medicines</td><td>H20193336</td><td>100 mg/kg para anestesia</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte compuesto (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>solución de ferrociniuro potásico</td><td>Sigma</td><td>14038-43-8</td><td>Añadir agua destilada a 50 ml</td></tr> de <tr><td>sacarosa</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>xilacina& nbsp;</td><td>Y-S Biotechnology</td><td>YS-(BC)-2842</td><td>15 mg/kg para anestesiar</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xfad mediante tinción de perls/dab

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

Para investigar la distribución y acumulación de hierro en un modelo de ratón de EA, realizamos la tinción de Perls/DAB en cortes sagitales de ratones 5xFAD de 8 meses de edad. Como se muestra en la Figura 3, se observaron señales de tinción de Perls/DAB en ratones 5xFAD y de tipo salvaje de 8 meses de edad y en ratones de tipo salvaje de 2 meses de edad. En ratones 5xFAD, se observaron señales de tinción de Perls/DAB altas en el hipocampo y la corteza, especialmente en el subículo del hipoc...

Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una de las características patológicas de la EA es la formación de placas de proteína amiloide β neuríticas positivo. En este protocolo se describen dos métodos de detección de placas neuríticas en ratones transgénicos modelo de AD: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thioflavin S.

La detección de placas neuríticas en el modelo de la enfermedad de Alzheimer ratón

Fuente: Mukherjee, K., et. al. Análisis de mitocondrias cerebrales mediante microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra la preparación,  imágenes y análisis del tejido cerebral de ratón utilizando un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) para visualizar la ultraestructura mitocondrial, lo que permite un mapeo preciso de su morfología y distribución espacial en compartimentos neuronales axonales y...

 Obtención de imágenes de mitocondrias neuronales mediante un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie

Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Cuantitativamente el mapeo de los metales en el tejido por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS) es una técnica analítica sensible que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo los metales participan en los procesos de funcionamiento y las enfermedades normales. A continuación, se describe un protocolo para obtener imágenes de los metales cuantitativamente en las secciones delgadas de tejido neurológico del ratón.

Metales de imagen en el tejido cerebral por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS)

En este estudio, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar la interrupción de la barrera sangre - cerebro en enfermedades neurodegenerativas. Para lograr nuestro objetivo, nos infunde isotiocianato de fluoresceína de alto peso molecular etiquetado (FITC)-albúmina en yugular de ratón de la vena y evaluado su salida en el parénquima cerebral por microscopía de fluorescencia.

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.

Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos

Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

El presente protocolo describe y compara el procedimiento para realizar un análisis de región o subregión de interés completa de secciones cerebrales de ratón sagitales para cuantificar la carga beta amiloide en el modelo de ratón transgénico APP / PS1 de la enfermedad de Alzheimer.

Cuantificación completa versus subregional de la carga beta amiloide en secciones cerebrales de ratón

El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

Modelado de infección vaginal ascendente, parto prematuro y morbilidad neonatal en ratones

Aprende a evaluar la deposición de hierro en cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB. Este protocolo histoquímico permite detectar y cuantificar acumulación de hierro en modelos de Alzheimer.

Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB

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