Producción de inóculo fúngico micorrízico arbuscular (AM) y evaluación fenotípica de la simbiosis entre arroz y MA en condiciones salinas

Mi investigación se centra en la formación y la función de la simbiosis micorrízica arbuscular, con el objetivo de comprender cómo las plantas establecen esta relación con los hongos AM y cómo se benefician de ella. Descubrimos que la simbiosis AM mejora la tolerancia a la sal en el arroz al mediar la expresión génica. Además, los tomates utilizan un factor de transcripción específico para establecer la simbiosis AM, que regula la expresión de hormonas peptídicas para promover el crecimiento de la raíz lateral. Nuestro objetivo es identificar nuevos factores de transcripción cruciales para la simbiosis de AM y analizar más a fondo los mecanismos moleculares detrás de la tolerancia a la sal mejorada por AM y la formación de raíces laterales inducida por AM.

[Narrador] Para comenzar, lave bien la arena con agua del grifo. Autoclave la arena para esterilizarla. Agregue 2/3 de la arena esterilizada a una olla. Agregue 1,000 esporas de hongos micorrícicos arbusculares, Rhizophagus irregularis, a la arena. Cubre la arena y las esporas con una fina capa de arena. Luego agregue 30 semillas de cebollino de ajo a la olla y cúbralas con una capa adicional de arena. Coloque la maceta en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz de 16 horas y un ciclo de oscuridad de ocho horas a 23,5 ° Celsius y 55% de humedad relativa. Durante la primera semana después de la inoculación, cubra las cebolletas de ajo con papel de alúmina para bloquear la luz. A partir de dos semanas después de la inoculación, fertilice las cebolletas de ajo dos veces por semana con 80 mililitros de solución Hoagland de concentración media y una vez por semana con 80 mililitros de agua. Después de 10 semanas, coseche las raíces de las cebolletas de ajo para teñir con azul de tripano y evaluar la colonización fúngica. Guarde el inóculo de arena seca en una bolsa de plástico en el refrigerador a 4 ° Celsius. Transfiera los trozos de raíz de cebollino de ajo inoculados en una solución de hidróxido de potasio al 10%. Incubar la mezcla a una temperatura superior a 90° Celsius durante 30 minutos. Retire la solución de hidróxido de potasio después de la incubación. Enjuague los trozos de raíz tres veces con agua doble destilada para eliminar el hidróxido de potasio residual. Incube los trozos de raíz en ácido clorhídrico molar 0.3 durante 15 minutos a dos horas. Retire la solución de ácido clorhídrico después de la incubación. Agregue 1 mililitro de solución azul de tripano al 0,1% a las piezas de raíz. Luego incubarlos a una temperatura superior a 90 ° Celsius durante ocho minutos. Lave los trozos de raíz manchados con glicerol ácido al 50%. Luego transfiera 10 piezas de raíz a portaobjetos. Agrega una gota de glicerol ácido al 50%. Selle los cubreobjetos de las diapositivas con esmalte de uñas para evitar fugas. Examine 10 campos de visión para cada raíz bajo un microscopio para registrar las estructuras fúngicas. Retire los agujeros de las semillas de arroz manualmente. Sumérgelos en etanol al 70% durante cuatro minutos y 30 segundos para esterilizarlo. Retire la solución de etanol al 70% de los tubos. Luego agregue lejía al 3% en el tubo y agite durante 30 minutos. Retire la solución de lejía y lave las semillas con agua estéril de doble destilación tres o cuatro veces dentro de una campana de flujo laminar. Cultive las semillas de arroz esterilizadas en medio Murashige-Skoog de concentración media que contenga agar al 0,8%. Incube las semillas a 30 ° Celsius en la oscuridad durante cinco días. Transfiera las plántulas de arroz a las condiciones de crecimiento con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas a 28 a 30 ° Celsius y 70% de humedad relativa durante dos días. Luego transfiera las plántulas de arroz a tubos de plástico que contengan arena esterilizada. No agregue ningún inóculo a un tubo etiquetado como "simulado". Luego agregue 5 mililitros de inóculo de arena que contenga esporas de Rhizophagus irregularis a otro tubo etiquetado como "prueba". Riegue las plantas de arroz con agua doble destilada todos los días durante la primera semana después de la inoculación. Fertilice las plantas cada dos días con una solución Hoagland de concentración media que contenga 25 micromoles de fosfato de dihidrógeno de potasio. A las cinco semanas después de la inoculación, trate un lote con 150 milimoles de cloruro de sodio. Riegue las plantas con una solución Hoagland de concentración media que contenga fosfato de dihidrógeno de potasio, cloruro de sodio y solo con agua corriente en diferentes días de la semana. Coseche las plantas a las ocho semanas después de la inoculación y mida su peso fresco. Coloque las plantas en un horno a 70 ° Celsius durante dos días para medir su peso seco. Utilice la tinción con azul de tripano para analizar los niveles de colonización fúngica. A las 10 semanas después de la inoculación, se observaron estructuras fúngicas, como vesículas y esporas características de la simbiosis micorrízica arbuscular en etapa tardía, en las raíces de cebollino de ajo, con niveles totales de colonización fúngica del 80%. A las ocho semanas después de la inoculación, las raíces de arroz colonizadas con inóculo de arena mostraron vesículas y esporas, con hifas intrarradicales al 91%, arbúsculas al 82%, vesículas al 95%, hifas extrarradicales al 46%, esporas al 2% y colonización total at 93%. En condiciones de estrés salino, las plantas de arroz micorrícico exhibieron menos puntas de hojas marchitas que las plantas simuladas. En condiciones no salinas, las plantas de arroz micorrícico mostraron una mayor biomasa de brotes que las simuladas. El estrés salino resultó en una biomasa de brotes severamente reducida de plantas simuladas en relación con las plantas micorrícicas. Los niveles de hifas extrarradicales aumentaron bajo estrés salino, mientras que otras estructuras fúngicas no se vieron afectadas, lo que indica que el estrés salino tuvo un impacto leve en la simbiosis MA.