Infección in vivo e in vitro de raíces de papa con nematodos parásitos de plantas para la evaluación de cambios estructurales inducidos

El protocolo describe la infección de las raíces de Solanum tuberosum con nematodos parásitos de plantas en condiciones de invernadero in vivo y las raíces transgénicas de papa in vitro para el análisis histoquímico de la estructura de la raíz mediante microscopía óptica.

La investigación sobre las infecciones por nematodos parásitos en los cultivos está influenciada por la variabilidad de las condiciones ambientales, lo que puede afectar significativamente los resultados experimentales y la reproducibilidad de los datos.

Hemos desarrollado cultivos in vitro de raíces transgénicas de papa con nematodos parásitos de plantas como una alternativa confiable que ocupa menos espacio, requiere menos tiempo para obtenerse y está libre de contaminación o variabilidad genética del huésped.

El seguimiento de la progresión temporal de la infección por nematodos en las raíces de los cultivos sigue siendo un desafío. Las técnicas de tinción diferencial proporcionan un método confiable para identificar sitios de infección y distinguir las etapas de vida de los nematodos con precisión.

En comparación con los ensayos en invernadero, las raíces pesadas de la papa apoyan un sistema continuo y de control para proporcionar todas las etapas del desarrollo de nematodos, independientemente de las variaciones estacionales o climáticas.

Por lo tanto, el protocolo descrito ofrece varias aplicaciones futuras prometedoras. Por ejemplo, permite estudios detallados sobre los mecanismos moleculares y celulares para proporcionar información sobre cómo los nematodos parásitos de las plantas infectan y manipulan a los huéspedes.

[Narrador] Para comenzar, lave una zanahoria con agua corriente del grifo y luego con una solución de detergente común para eliminar los escombros. Una vez seco con una toalla de papel, inserte una brocheta de metal esterilizada en la parte superior de la zanahoria, aproximadamente uno o dos centímetros hacia adentro. Con una botella de lavado equipada con una boquilla, humedezca la zanahoria con etanol al 96%. Seque la punta inferior de la zanahoria en un papel de filtro esterilizado. Luego páselo con cuidado a través de una llama. Con un pelador estéril, pele la zanahoria de arriba hacia abajo y repita el flameado. Después de desechar las secciones superior e inferior, coloque la sección central en una placa de Petri estéril. Con una cuchilla estéril y unas pinzas, corte secciones de un centímetro de grosor. Transfiera las secciones a placas de Petri estériles. Después de sellar la placa, manténgala bajo luz ultravioleta durante 60 minutos por cada lado para esterilizar los discos de zanahoria. Incube los discos de zanahoria a 25 grados centígrados en la oscuridad durante una o dos semanas. Luego, con una cuchilla estéril, haga una incisión en forma de X en el centro del disco de zanahoria, cortando solo hasta la mitad. Pipetee 50 microlitros de suspensión de nematodos de lesión radicular que contenga al menos 50 etapas de vida mixtas en la incisión. Después de sellar la placa de Petri, incube a 25 grados centígrados en la oscuridad hasta por tres meses. Para extraer los nematodos de la lesión radicular, transfiera los discos de zanahoria con necrosis visible a un tamiz de malla de 75 micrómetros con ocho centímetros de diámetro colocado en un recipiente de vidrio estéril. A continuación, vierta una solución antibiótica sobre el colador hasta que los discos estén cubiertos. Después de la incubación nocturna en la oscuridad, use una pipeta esterilizada para transferir los nematodos del fondo del recipiente a un bloque de tinción de vidrio esterilizado. Pipetea un mililitro de solución antibiótica en el bloque de tinción y deja que los nematodos se asienten durante 30 a 40 minutos. Pipetea la solución antibiótica usada y repite el proceso de lavado de cuatro a cinco veces. Use la suspensión del nematodo de la lesión de la raíz inmediatamente o guárdela a 11 grados centígrados. Seleccione tubérculos de papa del mismo tamaño y deseche los que tengan agujeros, magulladuras o secciones blandas. Llene macetas de cinco litros con una mezcla uno a uno de tierra y arena en autoclave y mezcle 22,5 gramos de fertilizante NPK de liberación lenta. Luego siembre las papas a una profundidad de nueve centímetros por debajo de la superficie del suelo. Coloque las macetas en un invernadero con una humedad del 50 al 70%. Riegue con frecuencia para mantener la humedad del suelo al 70% de la capacidad máxima de retención de agua, evitando temperaturas extremas. Una vez que las plantas de papa hayan emergido, cree de cuatro a seis agujeros distribuidos uniformemente alrededor de cada planta para ver la profundidad. Pipetee ocho mililitros de suspensión que contiene 30,000 nematodos vivos de lesiones radiculares en etapa de vida mixta en los agujeros. Luego, cubra los agujeros con la mezcla de tierra. Para macetas de control y macetas que contienen nematodos con lesiones radiculares, suspenda el riego el día de la inoculación. Después de dos meses de cultivo, arrancar las plantas de papa y separar los brotes y las raíces para pesarlos. Lave cuidadosamente el sistema radicular. Examine las raíces en busca de sitios de ataque de RLN utilizando técnicas de tinción adecuadas. Coloque los tubérculos de papa lavados y esterilizados en un recipiente. Cubra los tubérculos con una solución de lejía comercial al 25%. Cierra el recipiente y mezcla durante 15 minutos. Una vez que se deseche la lejía, enjuague los tubérculos tres veces con agua del grifo esterilizada. A continuación, en una campana de flujo, sumerja los tubérculos en una solución de etanol al 80% durante 15 minutos con agitación vigorosa. Después de pipetear el etanol, enjuague tres veces con agua del grifo esterilizada. Con un bisturí estéril, retire las porciones periféricas de los tubérculos. Seccionar la pieza central interior en segmentos de 0,5 centímetros de grosor. Para inocular las secciones, primero mezcle un mililitro de suspensión de Rhizobium rhizogenes con nueve mililitros de medio SH. Sumerja la punta de un bisturí estéril en la suspensión diluida y enrolle la superficie de los gajos de papa cinco veces. Una vez que los segmentos estén secos, colóquelos en medio SH semisólido e incube a 25 grados centígrados durante tres días en la oscuridad para facilitar la transfección de plásmidos. Al final del tercer día, transfiera los segmentos infectados a placas que contengan medio SH semisólido suplementado con antibióticos. Después de tres meses, use pinzas estériles para recolectar un grupo de un gramo de raíces transgénicas. Transfiera las raíces al centro del plato con medio SH fresco semisólido sin antibióticos. Para recolectar las masas de huevos de nematodos, obtenga las agallas de la raíz. Use un par de pinzas estériles de punta ultrafina para extraer cuidadosamente las masas de huevos bajo un microscopio estereoscópico binocular ajustado a un aumento de 20x. Coloque las masas de huevos en una placa de Petri tapada que contenga cinco mililitros de agua estéril del grifo y déjelas eclosionar durante 48 horas. A continuación, en una campana de flujo, pipetee cinco mililitros de la suspensión J2 que contiene 100 nematodos por mililitro en un tamiz de malla de 20 micrómetros. Después de lavar con agua estéril del grifo, sumerja la mitad inferior del tamiz que contiene nematodos J2 en una solución de peróxido de hidrógeno al 20% y mezcle con movimientos circulares durante 15 minutos. Dispense agua estéril del grifo a través del colador sobre los nematodos y repita el proceso de lavado dos veces. Incline el tamiz para que los nematodos se acumulen en el borde durante el lavado final. Luego, pipetea un mililitro de agua ultrapura estéril del borde del tamiz para recuperar los nematodos. En una campana de flujo, subcultive un grupo de un gramo de raíces transgénicas de papa en placas SH con 100 nematodos estériles. Monitorizar el cocultivo regularmente bajo un microscopio invertido con un aumento de 100x. Cuando las masas de huevos se hagan visibles, subcultive las raíces en una nueva placa mediana SH. El uso de discos de zanahoria resultó en un aumento promedio de 100 veces en las poblaciones de nematodos en tres meses. Las plantas de papa no mostraron síntomas visibles bajo el bajo número de poblaciones de nematodos con lesiones radiculares. Se observaron varias etapas de vida de Pratylenchus penetrans en la corteza de la raíz después de la tinción con fucsina ácida, lo que indica que la penetración del tejido y las lesiones necróticas asociadas eran claramente visibles en las áreas infectadas. El desarrollo de raíces transgénicas de papa mostró un crecimiento inicial de masa celular a lo largo de heridas inducidas por bisturí en la sección de tubérculos de papa, seguido de la aparición de raíces transgénicas. Se observó un crecimiento sostenido de las raíces en el medio de cultivo y los grupos de raíces se transfirieron con éxito al medio de cultivo fresco para un crecimiento continuo. Los cultivos de raíces transgénicas de papa se infectaron con éxito con juveniles de segunda etapa de Meloidogyne chitwoodi para establecer cocultivos de nematodos vegetales. Se observaron agallas radiculares que contenían hembras adultas y masas de huevos en los cultivos infectados. Los tejidos de las agallas formados por Meloidogyne chitwoodi fueron visibles después de la infección de las raíces de papa transgénicas con distintas etapas de desarrollo y reproducción de nematodos identificables, incluida la formación de masas de huevos y huevos.