Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

Debido a su importante potencial en la medicina regenerativa, cada vez se presta más atención a la biología y la manipulación de las células madre embrionarias humanas. En este vídeo, le mostramos cómo cultivar y mantener células madre embrionarias humanas en un estado pluripotente utilizando células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón y condiciones libres de alimentador en matrigel. Hola, soy Jinjiang de un micro título de laboratorio en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de California en Los Ángeles.

Hoy le mostraremos un procedimiento para cultivar células madre embrionarias humanas en fibra embrionaria de la boca, células alimentadoras de sangre y en condiciones libres de alimentador en gel metri. Este procedimiento consiste en la preparación de células embrionarias de fibroblastos bucales que generan medios de condición de metanfetamina para el crecimiento en gel de metri preparación de lugar y masas de Magel para la alimentación y el crecimiento de células madre de Embry humanas a lo largo del tiempo. Así que comencemos.

Para comenzar el procedimiento de cultivo, las células madre humanas similares a emry se colocan en embriones de ratón, fibroblastos o mes para dividir las células madre embrionarias humanas en placas en mes. Comenzamos con células madre embrionarias humanas confluentes y placas en una dilución de uno a seis, de uno a 10, dependiendo de la línea de células madre embrionarias en particular. Esto volverá a confluente en cinco a siete días después de la división antes de dividir realmente las células. Placas gelatinizadas preparadas con dos días de anticipación utilizando una solución de gelatina al 0,1% de checon.

Si está utilizando una placa de seis pocillos, agregue dos molinos en cada pocillo y déjelo reposar en una incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados 5% CO2 durante la noche. Al día siguiente, las matemáticas del plato en gelatinizado. Las mascarillas de placas de seis pocillos se pueden colocar hasta tres días antes si es necesario.

Sin embargo, no se recomienda utilizar celdas de más de tres días. Tome un frasco de CF OneFS irradiado o tratado con mitomicina C que contenga de cinco a seis veces 10 a las seis células de nitrógeno líquido y descongele durante dos minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de que las células se hayan descongelado, lávelas una vez con medios de metanfetamina tibios en un tubo Falcon de 15 mililitros con un número total de cinco a seis veces 10 por seis celdas.

Se pueden ver dos o tres placas de seis pocillos con tres milésimas de pulgada de medio en cada una. Bueno, asegúrese de que los mes se dispersen uniformemente después. Puede volver a colocar la placa en la incubadora durante la noche.

El día que vas a dividir las células madre embrionarias humanas. Prepare una solución fresca y estéril de colagenasa cuatro a una concentración de un mg por mil. Tenga en cuenta que la solución de colagenasa se puede almacenar a cuatro grados centígrados y usarse durante no más de dos semanas.

Retire todos los medios de los pocillos de células madre embrionarias humanas. Desea dividir y observar cada pozo una vez con dos molinos de uno caliente XPDS pH 7.4. A continuación, agregue un mililitro de solución de colagenasa cuatro e incube las células a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos.

Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de células madre sin factor de crecimiento de fibroblastos básico o BFGF a cada pocillo, luego las células madre se pueden levantar del fondo de los pocillos simplemente usando una pipeta de un mililitro para pipetear el medio que ya está en el pocillo hacia arriba y hacia abajo para cada pocillo. Esto tomará entre cinco y 10 repeticiones. A continuación, transfiera las células madre embrionarias humanas suspendidas a un tubo de halcón de 15 mililitros.

Una vez que haya recolectado las células, granule las células madre por centrifugación a temperatura ambiente a 200 veces G durante cinco minutos. A continuación, lávese uno a la vez con medios de células madre que carezcan de BFGF mientras se lavan las células madre embrionarias humanas. Saca los platos de metanfetamina.

Retire todos los medios de los pocillos y lávelos una vez con uno estéril y tibio XPBS pH 7.4. A continuación, añade 2,5 mililitros de medio de células madre embrionarias. Ahora suplementado con 10 nanogramos por mil, BFGF por pocillo.

A continuación, vuelva a suspender las células madre embrionarias humanas peletizadas en un volumen adecuado de medio de células madre, suplementado con 10 nanogramos por milésimo de pulgada BFGF. El volumen resuspendido depende de la relación de división. Pipetea con cuidado la suspensión hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para hacer grupos más pequeños, pero no tanto como para que tengas células individuales o colonias muy pequeñas.

Agregue 0.5 mililitros de suspensión de células madre embrionarias humanas por pocillo a los pocillos chapados en metanfetamina para lograr un volumen final de tres mililitros en cada pocillo. Puede verificar visualmente para asegurarse de que las células madre se distribuyan uniformemente antes de volver a colocar las placas en la incubadora durante la noche para que se asienten después de la siembra. Por lo general, las colonias tardarán unos días en adquirir su forma característica y su aspecto de borde.