15.3: Electrophorèse sur gel d’agarose d’ADN

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.

Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.

In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.

To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.

Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.

The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

L’électrophorèse sur gel d’agarose est une technique couramment utilisée pour séparer les molécules d’ADN en fonction de leur taille.

L’agarose – un polysaccharide dérivé des algues rouges – est ajoutée à un tampon tel que le Tris-acétate EDTA (TAE) ou le Tris-borate EDTA (TBE) et dissoute par chauffage.

Généralement, 1 gramme d’agarose est dissous dans 100 millilitres de tampon pour former une solution d’agarose à 1 %, bien que différentes quantités d’agarose puissent être ajoutées en fonction de l’application.

Pour colorer le gel, un colorant fluorescent, tel que le bromure d’éthidium, est souvent ajouté à la solution d’agarose. Le colorant s’intercale entre les bases de l’ADN et devient fluorescent sous la lumière UV.

La solution peut ensuite être versée dans des moules horizontaux. Un peigne est inséré dans le moulage en gel pour créer des puits dans lesquels des échantillons d’ADN peuvent être chargés.

La solution d’agarose est laissée intacte pour se solidifier en un gel.

Le gel est constitué de molécules d’agarose liées à l’hydrogène formant une matrice poreuse à travers laquelle les molécules d’ADN se déplacent.

Les échantillons d’ADN sont mélangés avec un tampon de chargement et chargés sur le gel. Le tampon de chargement contient du glycérol, ce qui augmente la densité des échantillons d’ADN et les aide à se déposer au fond des puits.

Le tampon contient également des colorants, tels que le cyanol de xylène et le bleu de bromophénol, qui aident à surveiller la progression des bandes d’ADN en migration.

Lorsqu’un potentiel électrique est appliqué sur toute la longueur du gel, l’ADN chargé négativement migre vers l’électrode positive, voyageant à travers les couches de pores de l’agarose.

Les molécules d’ADN plus grosses se déplacent plus lentement à travers les pores que les molécules plus petites, ce qui permet de séparer les molécules en fonction de leur taille.

La taille des pores dépend de la concentration d’agarose dans la solution. Plus la concentration d’agarose est élevée, plus la taille des pores est petite, ce qui aide à séparer les fragments d’ADN plus courts.

Sous la lumière UV, les molécules d’ADN colorées apparaissent sous forme de bandes fluorescentes. La position des bandes peut être comparée à des fragments d’ADN de tailles connues, appelés échelle d’ADN.

Les bandes d’une échelle servent de référence pour déterminer la taille des molécules d’ADN d’intérêt.