16.12: Hybridation in-situ

In situ hybridization (ISH) is a technique used to detect and localize specific DNA or RNA molecules in cells, tissue, or tissue sections using a labeled probe. The technique was first used in 1969 for the investigation of nucleic acids. It is currently an essential tool in scientific research and clinical settings, especially for diagnostic purposes.

Types of probes and labels

A probe is a complementary strand of DNA or RNA that binds to corresponding nucleotide sequences in a cell. Many different  probes, such as single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, antisense RNA probes or riboprobes, and synthetic oligodeoxynucleotide probes, are used in in situ hybridization. The choice of probe depends on several  factors, including their sensitivity, specificity, stability, and ease of penetration into the tissue sample.

These probes can be labeled with radioisotopes, fluorescent dyes, or other antigen molecules for detection purposes. The ³H, ³⁵S, and ³²P are widely used radiolabeled probes, while non-radioactive labels include biotin, digoxigenin, and fluorescein. These labels can be attached to the probe DNA molecule via end-labeling, nick-translation, or random primer synthesis methods. Detection methods, such as autoradiography, fluorescence microscopy, or immunohistochemistry, are used for target visualization based on the label attached to the hybridized probe. 

Advantages and disadvantages of in situ hybridization

One of the major advantages of in situ hybridization is that it can even be applied to frozen tissues to enable maximum use of tissues that are difficult to obtain. In addition, it can be combined with other techniques, such as immunohistochemistry, to detect protein and active mRNA in the sample. However, while working with samples that have low DNA and RNA copies, it may be difficult to identify targets using in situ hybridization.

L’hybridation in situ est une technique utilisée pour localiser l’ADN ou l’ARN dans des cellules cultivées ou dans des coupes de tissus chimiquement conservés.

L’hybridation in situ de l’ARN est utilisée pour surveiller l’expression d’un gène en détectant et en quantifiant les transcrits spécifiques de l’ARNm.

Les ARNm cibles sont détectés par des sondes d’ARN complémentaires simple brin qui sont créées par transcription in vitro d’une matrice d’ADN ou synthétisées par une réaction chimique.

Les sondes sont marquées avec des isotopes radioactifs, des fluorophores ou d’autres molécules rapporteures, telles que la biotine ou la digoxigénine, qui peuvent être liées et détectées par un anticorps marqué.

L’hybridation in situ de l’ARN comporte quatre étapes principales : la fixation tissulaire, la perméabilisation, l’hybridation et la détection.

Pour commencer, les tissus frais sont récoltés et traités chimiquement pour arrêter toute réaction biochimique dans le tissu et préserver son intégrité structurelle. Cette technique de conservation est appelée fixation tissulaire.

Ensuite, les protéines et les lipides du tissu doivent être éliminés pour que la sonde puisse accéder à l’ARN cible et le lier.

Pour dégrader les protéines et perméabiliser la membrane cellulaire, l’échantillon est traité avec de l’acide chlorhydrique 0,2 molaire et des enzymes telles que les protéinases, tandis que des détergents sont utilisés pour décomposer les lipides.

L’ARN cible est ensuite hybridé avec les sondes à une température juste en dessous du point de fusion de l’hybride ARN-sonde. Cela aide les sondes à se recuire avec les ARNm complémentaires. Les sondes non liées et faiblement liées sont retirées en effectuant plusieurs lavages.

La méthode de détection des sondes hybridées dépend du type d’étiquette. Les sondes radioactives sont exposées à des films photographiques, tandis que les sondes fluorescentes sont visibles au microscope fluorescent.

Pour d’autres marquages, les anticorps dirigés contre la molécule rapporteure sont marqués avec un colorant fluorescent ou colorimétrique.

La détection de sondes hybrides révèle la distribution d’ARNm spécifiques indiquant où les gènes d’intérêt sont exprimés.