Injection de cellules tumorales intracécales : une technique d’administration de cellules cancéreuses pour l’établissement d’un modèle murin de cancer colorectal orthotopique

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des lignées cellulaires pour l’injection

REMARQUE : Utiliser un volume de 20 μL avec 100 000 cellules pour chaque injection. Utilisez une matrice à membrane basale (BMM) pour éviter les fuites et assurer une injection standardisée. Pour garantir des résultats reproductibles, effectuez des tests d’authentification des lignées cellulaires (par exemple, via le profilage STR) à intervalles réguliers.

1. Cultivez toutes les lignées cellulaires du cancer colorectal dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO₂) et préparez-les le jour de l’opération.
2. Récoltez les cellules selon les protocoles de culture cellulaire standard, comptez les cellules (par exemple, dans un compteur de socs ou un hémocytomètre) et calculez la quantité requise pour toutes les injections en fonction du nombre d’animaux à injecter.
3. Préparez 3 à 5 fois le volume nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d’injection.
4. Centrifugez (5 min à 1 500 g) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS.
5. Remettre les cellules en suspension dans le BMM à une concentration de 5 x 10⁶ cellules/mL et les maintenir sur de la glace.

2. Modèle de souris orthotopique

1. Préparation des animaux receveurs à la chirurgie
   note: Utilisez NOD âgé de 6 à 8 semaines. Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, NSG) comme receveurs. NSG est l’une des souris les plus immunodéprimées, dépourvue de cellules B, T et NK matures et de multiples autres défauts immunitaires. Ils développent de manière fiable des tumeurs même si un faible nombre de cellules sont injectées et sont très sujets aux métastases à distance. Les souris NSG sont d’excellents reproducteurs et peuvent être maintenues dans des unités conventionnelles exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SPF).
   1. Avant la première incision, injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.
   2. Utilisez le sévoflurane à 3-3,5 % en volume pour l’anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement de l’orteil indique une anesthésie suffisante.
   3. Couvrez les yeux des souris anesthésiées avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée.
   4. Retenez les souris en position couchée sur une petite table.
   5. Rasez l’abdomen avec un rasoir électrique (une crème dépilatoire peut être utilisée en alternative) et désinfectez avec au moins 3 fois de chlorhexidine/iode et 70 % d’alcool.
   6. Couvrez le champ opératoire avec des champs stériles.
      note: L’utilisation d’antibiotiques périopératoires est facultative et soumise aux directives de l’établissement.
2. Laparotomie médiane et exposition du caecum
   1. À l’aide de ciseaux (les scalpels peuvent être utilisés en alternative), faire une petite incision médiane (3 à 5 mm) de la peau du bas-ventre. Prenez la musculature de la paroi abdominale avec une pince et incisez-la soigneusement avec des ciseaux, en ouvrant la cavité abdominale.
   2. Identifiez et extériorisez soigneusement le caecum à l’aide d’une pince atraumatique. Positionnez la poche à l’extrémité aveugle du caïcum sur l’abdomen, en pointant vers le crâne.
   3. Une fois extériorisé, gardez le caïcum humide à l’aide de tampons salins chauds en tout temps.
3. Injection orthotopique, fermeture de l’abdomen et récupération postopératoire
   1. Pour l’injection intragraphique, utilisez une seringue standard de 1 mL avec une canule de 30 G. Montez cette seringue sur une pompe de micro-injection, qui est, à son tour, montée sur un micromanipulateur.
   2. Saisissez soigneusement l’extrémité du caecum à l’aide d’une pince atraumatique et lissez-la doucement en la caressant vers le bas avec une deuxième paire de pinces imbibées d’une solution saline chaude.
   3. Positionnez la canule directement au-dessus du caecum
   4. Effectuez les étapes suivantes sous contrôle visuel à l’aide d’un microscope chirurgical binoculaire.
   5. Saisissez soigneusement le caïcum à l’aide de deux pinces atraumatiques aux deux extrémités de la partie extériorisée du caïcum, étirez-le légèrement, puis tirez-le lentement sur la canule, qui est positionnée parallèlement et directement au-dessus. Il est crucial de ne pas perforer toute la paroi intestinale (injectant ainsi les cellules dans la lumière) ainsi que de ne pas perforer la séreuse au-delà du point de pénétration initial, car cela entraînerait des fuites et une dissémination péritonéale.
      1. Déplacez l’intestin vers la canule, et non la canule vers l’intestin. Tenez et étirez l’intestin entre deux pinces. Les mains du chirurgien doivent reposer sur une surface pour réduire les tremblements.
   6. Injectez les cellules entre la séreuse (considérée comme une paroi très fine et translucide au-dessus des vaisseaux sanguins intramuraux) et la musculaire. La canule doit donc être placée visuellement au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la fine membrane translucide.
   7. Utilisez une pédale pour commencer l’injection afin de réduire les tremblements pendant que la canule est à l’intérieur de la paroi intestinale.
   8. Une fois la canule en place, lancez l’injection. Utilisez une durée de 20 s, ce qui permet de régler 1 μL/s sur l’unité de commande de la pompe.
      note: L’injection dans ou à proximité d’un vaisseau sanguin endommagé entraîne une dissémination intravasculaire directe et des métastases à distance et doit donc être évitée.
   9. Une fois l’injection terminée, retirez délicatement la canule en la tirant vers l’arrière.
   10. Placez un tampon sec sous le caïcum, puis rincez abondamment le caïcum avec de l’eau distillée pour lyser les cellules qui fuient et ainsi empêcher la dissémination péritonéale artificielle.
4. Fermeture de l’abdomen et récupération postopératoire
   1. Après le rinçage, remettez doucement le caïcum dans la cavité abdominale.
   2. Fermez la paroi abdominale avec des sutures de course 6-0 rapidement résorbables.
   3. Fermez la peau à l’aide de pinces chirurgicales.
   4. Placez la souris sur une carte chauffante réglée à 38 °C jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie.
   5. Observez de près l’état postopératoire des souris pendant les 48 heures suivantes. En cas de détresse, traiter avec 0,05 mg/kg de buprénorphine toutes les 12 h.
   6. Surveillez les souris au moins une fois par jour pour détecter des signes de détresse dus à la croissance tumorale.