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Abstract

Source : Merenda, A. et al., Un protocole pour l’inactivation de plusieurs gènes dans les organoïdes de l’intestin grêle de souris à l’aide d’un concatémère CRISPR. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit une technique d’inactivation de gènes utilisant un concatéreur CRISPR pour inactiver simultanément plusieurs gènes dans des cellules organoïdes intestinales de souris en culture. Cette méthode est utilisée pour éliminer un gène malade et pour élucider la fonction d’un gène et de ses paramètres.

Protocol

1. Conception d’ARNg pour le vecteur concatéreur CRISPR

REMARQUE : L’objectif de cette section est d’expliquer comment opter pour la meilleure stratégie de ciblage et comment concevoir des ARNg contenant des surplombs spécifiques pour le vecteur CRISPR-concatemer.

1. Concevez des ARNg contre les gènes d’intérêt à l’aide d’un outil de conception d’ARNg CRISPR de votre choix. Voir la table des matériaux pour un exemple.
   note: Lorsque l’on cible une paire de gènes paralogues, bien qu’il soit possible de concevoir un ARNg par gène, il est conseillé de concevoir deux ARNg par gène pour augmenter les chances d’obtenir un double knock-out (Figure 1).
2. Assurez-vous que les ARNg ne contiennent pas le site de reconnaissance BbsI à l’aide d’un outil de cartographie de restriction (voir le tableau des matériaux pour un exemple).
3. Ajoutez des surplombs vectoriels CRISPR-concatemer spécifiques à chaque oligo, comme indiqué dans le tableau 1.

2. Clonage d’ARNg dans le vecteur concatéreur CRISPR

1. Phosphorylation et recuit des oligos
   note: Cette étape illustre comment recuire les brins supérieur et inférieur de chaque oligo d’ARNg et comment phosphoryler leurs extrémités en une seule réaction.
   1. Préparez le mélange réactionnel pour la phosphorylation des oligos et le recuit des brins supérieur et inférieur sur de la glace, selon les instructions ci-dessous.
      note: Tous les oligonucléotides peuvent être regroupés en une seule réaction ; par exemple, dans le cas d’un vecteur concatémère de 4 ARNg, regroupez 8 oligos.
   2. Pour 3 concatémères, utilisez 3,0 μL d’ARNg brin supérieur (1,0 μL de chaque ARNg ; 10 μM, 1 μL/ARNg), 3,0 μL d’ARNg inférieur (1,0 μL de chaque ARNg ; 10 μM, 1 μL/ARNg), 2,0 μL de tampon d’ADN ligase T4 (10x), 1,0 μL de T4 PNK, et ajoutez H₂O jusqu’à un volume total de 20,0 μL.
   3. Bien mélanger par pipetage et passer dans un thermocycleur en utilisant les réglages suivants : 37 °C pendant 30 min, 95 °C pendant 5 min, descendre à 25 °C à 0,3 °C/min, maintenir à 4 °C.
2. BbsI mélange réaction
   note: Dans cette section, les oligonucléotides d’ARNg pré-recuits sont incorporés dans la position appropriée du vecteur concatémère en une seule étape en alternant les cycles de digestion et de ligature.
   1. Diluer le mélange réactionnel 1:100 dans de l’eau exempte de DNase/RNase pour générer 3 et 4 vecteurs concatémères d’ARNg.
      note: Lors du clonage de 2 concatémères d’ARNg, cette étape n’est pas nécessaire.
   2. Assemblez la réaction de mélange BbsI sur de la glace, selon les instructions ci-dessous. Incluez un contrôle négatif qui ne contient que le vecteur.
   3. Utilisez 100 ng de vecteur CRISPR-concatemer, 10,0 μL d’oligo-mélange, 1,0 μL de tampon d’enzyme de restriction contenant de la BSA (10x), 1,0 μL de DTT (10 mM), 1,0 μL d’ATP (10 mM), 1,0 μL de BbsI, 1,0 μL de T7 ligase et H₂O jusqu’à un volume total de 20,0 μL.
   4. Mélangez bien par pipetage et exécutez-le dans un thermocycleur en utilisant les paramètres suivants : Exécutez 50 cycles pour cloner 3 et 4 concatémères d’ARNg et 25 cycles pour 2 concatémères d’ARNg, tous deux à 37 °C pendant 5 min, 21 °C pendant 5 min, maintenez à 37 °C pendant 15 min, puis 4 °C pour toujours.
3. Traitement à l’exonucléase
   note: Cette étape est fortement recommandée car elle augmente l’efficacité du clonage en supprimant toute trace d’ADN linéarisé.
   1. Traitez la réaction de mélange BbsI avec une exonucléase d’ADN (voir le tableau des matériaux) comme suit.
   2. Prélever 11,0 μL de mélange de ligature de l’étape précédente (2.2.3), ajouter 1,5 μL de tampon d’exonucléase (10x), 1,5 μL d’ATP (10 mM), 1,0 μL d’exonucléase d’ADN et porter le volume total à 15,0 μL avec de l’eau. Incuber à 37 °C pendant 30 min puis à 70 °C pendant 30 min
      note: Cette étape élimine tout ADN linéarisé résiduel dans le mélange et augmente ainsi l’efficacité du clonage.
   3. Utiliser 2 μL du mélange réactionnel pour la transformation en bactéries E. coli chimiquement compétentes par choc thermique.
      REMARQUE : Alternativement, la réaction peut être stockée jusqu’à une semaine à -20 °C.

3. Transfection d’organoïdes intestinaux par électroporation

NOTE : Veuillez noter que cette procédure est basée sur le protocole publié par Fujii et al. en 2015, avec adaptation pour les cultures d’organoïdes de l’intestin grêle de souris.

1. Pré-électroporation
   note: Cette section décrit comment préparer les organoïdes intestinaux de souris avant l’électroporation en retirant tous les antibiotiques et les milieux conditionnés de leur milieu de culture. Cela permettra d’éviter d’éventuels effets toxiques lors de l’électroporation.
   1. Le jour 0 de la procédure de transfection, divisez les organoïdes dans un rapport de 1:2.
      REMARQUE : Des cultures d’organoïdes intestinaux peuvent être obtenues en effectuant l’isolation de la crypte selon des protocoles préalablement établis. Veuillez vous référer au tableau 2 pour toutes les compositions de supports.
      1. Lors de la division d’organoïdes pour l’électroporation, ensemencez un minimum de 6 puits d’une plaque de 48 puits par transfection.
      2. Semez les organoïdes dans des gouttes matricielles de 20 μL et cultivez-les dans un milieu WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide) à 37 °C, 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié (comme décrit précédemment).
   2. Le jour 2, changer de milieu en remplaçant WENR+Nic par 250 μL de EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3) + Y-27632 (inhibiteur de ROCK), sans antibiotiques (voir tableau 2).
      REMARQUE : Dans toutes les étapes, la quantité de fluide ajoutée à chaque puits d’une plaque de 48 puits est de 250 μL.
   3. Le jour 3, changez le milieu organoïde en EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v de diméthylsulfoxyde (DMSO), sans antibiotiques.
2. Préparation des cellules
   note: Nous décrivons ici comment fragmenter les organoïdes en petits amas de cellules par dissociation mécanique et chimique. Ces étapes sont essentielles au succès de la procédure.
   1. Le jour 4, perturbez les dômes de la matrice sous-jacente à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml et transférez les organoïdes dans un tube de 1,5 ml. Pool du contenu de quatre puits d’une plaque de 48 puits dans un tube.
   2. Cassez mécaniquement les organoïdes en petits fragments en pipetant de haut en bas avec une pipette P200 environ 200 fois. Centrifugeuse à température ambiante, 5 min à 600 x g.
   3. Retirer le milieu et remettre la pastille en suspension dans 1 mL d’une protéase recombinante de qualité culture cellulaire (voir le tableau des matériaux). Incuber à 37 °C pendant 5 min maximum, puis vérifier une goutte d’échantillon de 50 μL sous un microscope à lumière inversée avec un objectif 4x.
      note: Des grappes de 10 à 15 cellules sont souhaitables, car elles augmentent la survie cellulaire après électroporation.
   4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml à faible liaison et arrêtez la dissociation en ajoutant 9 ml de milieu basal sans antibiotiques (voir le tableau 2). Centrifuger à température ambiante, 5 min à 600 x g, puis jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux).
   5. Comptez le nombre de cellules avec une chambre de Bürker et utilisez un minimum de 1 x 10⁵ cellules par réaction d’électroporation. Ajouter 9 ml de milieu sérique réduit dans le tube de 15 ml et centrifuger à température ambiante, 3 min à 400 x g.
3. Électroporation
   note: Les sections suivantes fournissent des instructions sur la façon d’effectuer l’électroporation et de faire récupérer les organoïdes par la suite.
   1. Retirez tout le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une solution d’électroporation (voir le tableau des matériaux). Ajoutez une quantité totale de 10 μg d’ADN dans la suspension cellulaire et ajoutez la solution d’électroporation jusqu’à un volume final de 100 μL et maintenez le mélange cellule-ADN sur de la glace. Utilisez des vecteurs CRISPR-concatamer en combinaison avec un plasmide d’expression Cas9 (par exemple, Addgene #41815) dans un rapport de 1:1.
      note: Le volume total de l’ADN ajouté doit être inférieur ou égal à 10 % du volume total de la réaction.
   2. Incluez un mélange de transfection séparé contenant un plasmide GFP pour évaluer l’efficacité de la transfection (par exemple, pCMV-GFP, Addgene #11153, ou tout plasmide générique exprimant la GFP).
   3. Ajoutez le mélange cellule-ADN dans la cuvette d’électroporation et placez-le dans la chambre d’électroporation. Mesurez l’impédance en appuyant sur le bouton approprié de l’électroporateur et assurez-vous qu’elle est comprise entre 0,030 et 0,055 kΩ. Effectuez l’électroporation selon les réglages indiqués dans le tableau 3.
      note: Si la valeur d’impédance est en dehors de la plage autorisée, ajustez le volume de la solution dans la cuvette.
   4. Ajoutez 400 μL de tampon d’électroporation + Y-27632 dans la cuvette, puis transférez le tout dans un tube de 1,5 ml. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour permettre aux cellules de récupérer, puis les faire tourner à température ambiante pendant 3 min à 400 x g.
   5. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 20 μL/puits de matrice du bas-bas. Ensemencer environ 1 x 104 à 1 x 105 cellules par puits dans une plaque de 48 puits et ajouter EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v de milieu DMSO. Incuber à 37 °C.
   6. Le jour 5, changez le milieu en EN + CHIR99021 + Y-27632 et vérifiez l’efficacité de la transfection en observant l’expression de la GFP (Figure 2). Maintenir les organoïdes à 37 °C et rafraîchir le milieu EN + CHIR99021 + Y-27632 après 2 jours.
   7. Le jour 9, changer le milieu en WENR + Nic + Y-27632 et incuber à 37 °C.
      note: Y-27632 peut être retiré après 7 à 10 jours (les jours 16 à 19).

	Cassette 1	Cassette 2	Cassette 3	Cassette 4
Séquence (5′-3′)	CACCGG[ARNg1]GT	ACCGG[ARNg2]G	CCGG[ARNg3]	ACACCGG[ARN4]GTT
Séquence (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-ARNg2]C	AAAC[ARNgRC3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

Tableau 1 : Porte-à-faux pour chaque cassette du vecteur concatéméraire CRISPR.

Milieu basal		Commentaires
Conserver à 4 °C pendant 4 semaines
Milieu de culture cellulaire	500 ml	Voir le tableau des matériaux
L-Glutamine	100 x 5 mL
Agent tampon 1 M	5 mL	Voir le tableau des matériaux
Pénicilline Streptomycine	100 x 5 mL
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rsactin + Nicotinamide)
Conserver à 4 °C pendant 2 semaines
Milieu basal	jusqu’à 50 mL
Supplément sans sérum de cellules neuronales (50x)	1 mL	Voir le tableau des matériaux
Supplément sans sérum de cellules neuronales (100x)	500 μL	Voir le tableau des matériaux
n-Acétylcystéine (500 mM)	125 μL
EGF de souris (100 μg/mL)	25 μL
Noggin de souris (100 μg/mL)	50 μL
Milieu conditionné R-Spondin	5 mL
Milieu conditionné Wnt3a	25 ml
Nicotinamide (1 M)	250 μL
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632)
Conserver à 4 °C pendant 2 semaines
Milieu basal sans pénicilline Streptomycine	jusqu’à 20 mL
Supplément sans sérum de cellules neuronales (50x)	400 μL	Voir le tableau des matériaux
Supplément sans sérum de cellules neuronales (100x)	200 μL	Voir le tableau des matériaux
n-Acétylcystéine (500 mM)	50 μL
EGF de souris (100 μg/mL)	10 μL
Noggin de souris (100 μg/mL)	20 μL
Y-27632 (10 μM)	20 μL
CHIR99021 (8 μM)	10 μL
EN (EGF + Noggin)
Conserver à 4 °C pendant 4 semaines
Milieu basal	jusqu’à 50 mL
Supplément sans sérum de cellules neuronales (50x)	1 mL	Voir le tableau des matériaux
Supplément sans sérum de cellules neuronales (100x)	500 μL	Voir le tableau des matériaux
n-Acétylcystéine (500 mM)	125 μL
EGF de souris (100 μg/mL)	25 μL
Noggin de souris (100 μg/mL)	50 μL

Tableau 2 : Composition des milieux organoïdes.

	Impulsion de poring	Impulsion de transfert
tension	175 V	20 V
Durée de l’impulsion	5 ms	50 ms
Intervalle d’impulsion	50 ms	50 ms
Nombre d’impulsions	deux	5
Taux de décomposition	10 %	40 %
polarité	+	+/-

Tableau 3 : Paramètres d’électroporation.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672