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Abstract

Source : Tirumalai, V., et al. pour la détection et la quantification des microARN végétaux. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons le Northern blot, une technique d’hybridation permettant de détecter et de quantifier les microARN (miARN) à partir de l’ARN total extrait des tissus végétaux.

Protocol

1. Électrophorèse sur gel

1. Arrêtez le pré-cycle et lavez les puits avant le chargement de l’échantillon.
2. Chauffer les échantillons à 98 °C pendant 1 min et charger les échantillons chauds dans le puits à l’aide d’embouts capillaires. Insérez la pointe dans le fond du puits de manière à ce que l’échantillon occupe une fine couche dans le puits.
3. Chargement complet de tous les échantillons. Inclure le chargement du marqueur de décennie de l’ARN.
4. Faites couler le gel à 80 V jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol coule presque complètement. Le bleu de bromophénol coule à 10 pb dans un gel d’acrylamide dénaturant à 15 %.

2. Préparation à l’électro-transfert

1. Coupez la membrane N+nylon aux dimensions d’une plaque de verre et étiquetez la membrane dans son coin supérieur droit avec un crayon HB.
2. Placez délicatement la membrane à la surface de l’eau stérile, face au côté étiqueté vers la surface de l’eau. Pré-tremper la membrane pendant 15 min.
3. Coupez 4 morceaux de papier buvard I aux dimensions d’un tampon en fibre.
4. Préparez le sandwich au gel en plaçant le côté gris de la cassette dans un plateau propre.
5. Pré-mouillez le tampon en fibre et placez-le sur la cassette. Éliminez les bulles d’air.
6. Pré-mouillez un morceau de papier buvard dans 1x TBE et placez-le sur le tampon en fibre. Éliminez les bulles d’air en faisant rouler une pipette en plastique sur le papier. Posez un autre morceau de papier buvard pré-humide et retirez les bulles d’air.
7. Retirez délicatement le gel de la cassette en cours d’exécution et placez-le sur la configuration sandwich, de sorte que le premier échantillon d’ARN chargé soit vers la droite.
8. Trempez doucement la membrane pré-trempée dans 1x TBE et placez-la sur le gel, face à l’étiquette vers le bas. Étalez pour éliminer les bulles d’air.
9. Trempez un morceau de papier buvard, posez-le sur la membrane et retirez les bulles d’air. Trempez un autre morceau de papier buvard, placez-le sur la configuration du sandwich et retirez les bulles d’air.
10. Complétez le sandwich en plaçant un tampon en fibre pré-humide sur la configuration et en fermant fermement la cassette.
11. Placez la cassette transblot dans le module et remplissez 1x TBE, pH 8,2, jusqu’au repère buvard.
12. Transfert à 10 V, une nuit à 4 °C.
13. Après le transfert, placez la membrane humide sur une feuille de papier et réticulez immédiatement l’ARN à la membrane par irradiation avec une lumière UV de 254 nm (120 000 μjoules/cm²). Le transfert réticulé peut être stocké à 4 °C pour une hybridation ultérieure.

3. Préparation de la sonde radiomarquée

1. Concevoir une sonde complètement complémentaire au petit ARN à détecter.
2. Étiquetez la sonde à l’aide du ƳP32ATP (obtenu à partir de BRIT) à son extrémité 5′ en combinant les composants selon la recette fournie dans le tableau 1.
3. Incuber le mélange réactionnel ci-dessus à 37 °C pendant 30 min.
4. Séparez le ƳP32ATP non étiqueté de la sonde à l’aide d’une colonne Sephadex G-25 conformément au protocole du fabricant.

4.Hybridation du blot

1. Placez le transfert réticulé, côté ARN vers le haut, à l’intérieur d’une bouteille d’hybridation.
2. Mélangez vigoureusement le tampon d’hybridation ultra-sensible, ajoutez-en 10 mL et incubez le blot à l’intérieur d’un four d’hybridation maintenu à 35 °C, avec rotation.
3. Effectuer une pré-hybridation pendant 20 min.
4. Sortez la bouteille du four et ajoutez délicatement la sonde étiquetée dans le tampon d’hybridation.
5. Hybrider le blot à 35 °C, avec rotation pendant 12 h.
6. Après l’hybridation, transférez soigneusement la solution d’hybridation dans un tube de 15 ml. Cette solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à sa réutilisation.
7. Effectuez un lavage rapide du transfert pendant 2 minutes pour éliminer l’excès de solution d’hybridation en ajoutant 2 tampons SSC plus 0,5 % de SDS. Jetez la solution.
8. Incuber le transfert avec 2 tampons SSC plus 0,5 % SDS pendant 35 °C, avec rotation pendant 30 min.
9. Lavez à nouveau le tampon avec 0,5 tampon SSC plus 0,5 % SDS pendant 35 °C, avec rotation pendant 30 min.
10. Placez le tampon à l’intérieur d’un couvercle d’hybridation, retirez l’excédent de tampon et scellez-le.
11. Exposez-le à un écran d’imageur au phosphore sans rayonnement pendant la nuit à l’intérieur d’une cassette.
12. Détectez le signal d’hybridation à l’aide d’un imageur biomoléculaire et analysez les résultats à l’aide d’un logiciel approprié.

Table 1 : Table des recettes

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Tampon et solution	recette	Commentaires
10 X TBE	Tampon Tris 0,89 M	Le pH doit être réglé à 8,2 à l’aide d’acide acétique
	0,89 M Acide borique
	30 millions d’EDTA
Mélange de gel	15 % d’acrylamide-bisacrylamide sol, 19:1	Le mélange de gel ne doit pas contenir de cristaux d’urée
	8M d’urée
	1X TBE
Colorant de chargement de gel	0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol	Des précautions doivent être prises lors de la manipulation du formamide désionisé
	0,05 % (p/v) Xylène xyanol
	100 % désionisé – formamide
Étiquetage de la sonde	Tampon PNK (10X, 2 μL)	Ce mélange contient des molécules radioactives, cette étape doit être effectuée par du personnel formé à l’intérieur d’un laboratoire radioactif
	Enzyme PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Tampon de lavage – I	2X SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Tampon de lavage – II	0,5 fois le SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Tampon de décapage – I	0,5 fois le SSC
	0,1 % (p/v) de SDS
Tampon de décapage – II	0,1X SSC
	0,1 % (p/v) de SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay