Transplantation de cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de souris

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Procédure de transplantation

1. Préparation à la chirurgie
   1. Nettoyez et stérilisez le matériel chirurgical.
   2. Préparez l’appareil stéréotaxique et le système de pompe de micro-injection.
      REMARQUE : Il est essentiel de tester la seringue Hamilton et l’aiguille de 30 G de 2 pouces avant de commencer. Insérez l’aiguille dans un tube contenant du NaCl (chlorure de sodium) stérile à 0,9 % et aspirez lentement la solution vers l’intérieur et vers l’extérieur.
   3. Installez l’appareil d’anesthésie. Testez la machine avant d’impliquer des animaux. Nettoyez la chambre d’induction avec de l’éthanol à 70 %.
2. Préparation des animaux
   1. Conservez les souris pendant au moins 7 jours avant les expériences dans des conditions standard pour les acclimater.
      NOTE : Les animaux suivants ont été utilisés pour ce protocole : femelles NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, également connu sous le nom de NSG) et femelles C57BL/6J (20-25 g, également connu sous le nom de B6). La procédure peut également être effectuée avec des souris mâles.
   2. Mesurez le poids corporel de la souris et ajustez la dose d’analgésique à injecter. Administrer du carprofène (5 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour réduire la douleur et/ou prévenir une réponse inflammatoire.
   3. Anesthésier les animaux à l’aide d’isoflurane (3 % dans la phase d’induction et 1,5 à 2 % dans la phase d’entretien pendant la chirurgie) vaporisé dans de l’oxygène.
      REMARQUE : L’anesthésie gazeuse est préférée en raison d’un réveil rapide après l’intervention chirurgicale et parce que les niveaux de gaz anesthésique peuvent être facilement ajustés.
   4. Utilisez des réflexes nociceptifs pour vous assurer que l’animal est profondément anesthésié (p. ex., pincement des orteils). Lorsqu’une anesthésie profonde est atteinte, transportez l’animal de la chambre d’induction au cadre stéréotaxique. Maintenez l’anesthésie à l’aide d’un masque facial.
      REMARQUE : La fréquence respiratoire doit être surveillée visuellement tout au long de la procédure (40 à 60 respirations par minute). Utilisez un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant la procédure.
   5. Appliquez un lubrifiant ophtalmique pour éviter que les yeux ne se dessèchent.
   6. Rasez le cuir chevelu de la souris avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec une solution de bétadine à 5 % à l’aide de cotons-tiges.
   7. Fixez la tête de la souris et insérez les barres d’oreille dans le méat externe.
      REMARQUE : Veillez à ne pas endommager les tympans. Appliquez la pommade à la lidocaïne sur les deux conduits auditifs avant d’insérer les barres auriculaires. Pour vérifier si la tête de l’animal est dans une position stable, appuyez soigneusement sur la tête pour voir s’il y a du mouvement. Si un mouvement est noté, la barre d’oreille, le placement de l’embout nasal ou les deux sont incorrects et doivent être réajustés.
3. Craniotomie
   1. Utilisez une lame chirurgicale pour faire une coupe le long de la ligne médiane assez grande pour révéler les points de repère lambda et bregma.
      REMARQUE : Des écarteurs de peau peuvent être appliqués pour garder le crâne exposé.
   2. Rétractez le périoste et le fascia à l’aide d’un scalpel et utilisez des cotons-tiges stériles pour sécher la surface du crâne.
   3. Ajustez les barres d’oreille et de bouche pour normaliser la position de la tête.
      REMARQUE : Les coordonnées verticales pour le bregma et le lambda doivent être identiques pour le positionnement antéropostérieur.
   4. Placez l’aiguille au niveau du bregma et calculez les coordonnées des points d’injection souhaités (les coordonnées d’intérêt choisies pour ce protocole : antéro-postérieure (AP) : + 0,5 mm, médiale-latérale (ML) : + 1,5 mm). Déplacez l’aiguille jusqu’à ce point et marquez-la avec ink.
      REMARQUE : Les coordonnées ont été choisies sur la base de l’Atlas du cerveau de souris Franklin et Paxinos. Les distances sont de mm par rapport au bregma.
   5. Appliquez du NaCl stérile à 0,9 % sur le crâne et percez un trou d’un diamètre de 2 à 3 mm à travers le crâne à l’aide d’une perceuse dentaire chirurgicale.
   6. Déplacez l’aiguille à la surface de la dure-mère et calculez les coordonnées de profondeur.
4. Procédure de transplantation
   1. Remettre en suspension les cellules progénitrices neurales humaines transduites virales dans le tube et aspirer 2 μL de suspension cellulaire dans une seringue (5 μL ou 10 μL).
      REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la suspension cellulaire. La seringue doit être maintenue en position horizontale jusqu’à ce qu’elle soit montée dans le dispositif stéréotaxique pour éviter la sédimentation cellulaire.
   2. Placez la seringue au-dessus du site cible (coordonnées calculées : AP : + 0,5 mm, ML : + 1,5 mm) et déplacez lentement l’aiguille vers la surface du dura.
      REMARQUE : Si vous n’êtes pas sûr des coordonnées correctes, effectuez des injections avec un colorant et une évaluation histologique du site d’injection avant de transplanter les cellules.
   3. Guidez l’aiguille à une vitesse de 0,02 mm/s dans le cerveau jusqu’à la bonne profondeur (la coordonnée choisie pour ce protocole est dorsale-ventrale (DV) - 0,8 mm). Dépassez la profondeur de 0,1 mm et retirez l’aiguille sur la même distance pour créer une poche pour les cellules injectées.
   4. Appliquez de l’adhésif tissulaire autour de l’aiguille à l’aide d’une pince pour éviter les fuites de cellules.
   5. Injecter 2 μL de la suspension cellulaire préparée à un débit constant de 3-5 nL/s.
      REMARQUE : La procédure d’injection durera entre 7 et 12 min.
   6. Après l’injection, laissez l’aiguille en place pendant au moins 5 minutes avant de la retirer lentement. Appliquez un adhésif tissulaire pour sceller le trou dans le crâne et attendez encore 2 min.