Mesures du flux d’oxygène pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes et perméabilisées

1. Ajout de cellules HEK 293T à la chambre de respirométrie haute résolution

1. Ajoutez le milieu de respiration mitochondriale MiR05 dans la chambre Oroboros propre. Fermez la chambre en insérant le bouchon et siphonnez l’excès de fluide du réceptacle du bouchon à l’aide du système d’aspiration.
2. Pour ajouter des cellules HEK 293T à la chambre par remplacement partiel du volume, calculez le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour atteindre une concentration cellulaire expérimentale de 1 million/mL.
3. Retirez le bouchon de la chambre.
4. Prélever un volume de MiR05 de la chambre correspondant au volume calculé de la suspension de la matrice cellulaire à l’aide d’une pipette.
5. Remettez soigneusement la suspension de la pellicule à l’aide d’une pipette.
6. Ajoutez le volume calculé de la suspension de la crosse cellulaire dans la chambre.
   NOTE: La chambre de respirométrie doit être propre et remplie de MiR05, le capteur d’oxygène polarographique doit être étalonné à une température stable et un protocole de titrage SUIT (Substrate-uncoupler-inhibitor titration) doit être chargé au préalable dans le logiciel DatLab. La concentration de l’échantillon expérimental ou de la cellule peut varier en fonction de l’échantillon ou du type de cellule. La figure 1 montre un exemple de respirométrie à haute résolution de cellules HEK 293T.
7. Fermez la chambre en insérant le bouchon et en vous assurant qu’aucune bulle n’est piégée à l’intérieur de la chambre.
   1. Siphonnez tout excès de liquide du réceptacle d’arrêt.
8. Attendez la stabilisation du flux d’oxygène, ce qui prend généralement environ 15 min.

2. Manipulation des microseringues

1. Préparez les microseringues.
   1. Sélectionnez et nettoyez la microseringue appropriée en fonction du type de produit chimique et du volume à titrer. Placez la microseringue sur le support à seringues.
   2. Remplissez la seringue en prenant soin d’éviter d’inclure des bulles de gaz.
      NOTE: Si des bulles de gaz se forment, éliminez-les en déplaçant lentement le piston vers le haut et rapidement vers le bas plusieurs fois.
2. Vérifiez le protocole SUIT pour le volume requis du produit chimique à titrer.
   1. Remplissez la seringue avec au moins 1 μL de plus que le volume requis.
   2. Appuyez sur le piston jusqu’à ce que le repère souhaité sur le cylindre en verre soit atteint, en veillant à ce qu’une petite goutte apparaisse à la pointe de l’aiguille (amorçage).
   3. Essuyez la goutte sur la paroi du flacon chimique avant de procéder au titrage.

3. Titrage des produits chimiques selon le protocole SUIT

1. Titrez les produits chimiques indiqués par le protocole SUIT.
   NOTE: Ouvrez la fenêtre de l’événement DatLab en cliquant sur l’événement dans la barre latérale du protocole avant de le titrer.
   1. Insérez complètement l’aiguille à travers le capillaire du bouchon jusqu’à ce que l’extrémité du corps en verre soit en contact avec le bouchon.
   2. Injectez rapidement le produit chimique dans la chambre. ​
      NOTE: Après une injection, un artefact de titrage rapide et transitoire peut apparaître sous la forme d’un pic dans le flux d’O₂ (Figure 2A).
   3. Ajouter la digitonine à une concentration finale de 5 μg/mL.
      PRUDENCE: La digitonine est toxique en cas d’ingestion.
   4. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement pour définir l’événement correspondant.
   5. Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon.
   6. Attendez la stabilisation du flux d’oxygène et enregistrez pendant au moins 2 min.
   7. Ajouter du pyruvate dans la chambre pour atteindre une concentration finale de 5 mM. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement pour définir l’événement correspondant.
      NOTE: Effectuez le titrage suivant sans délai.
   8. Ajouter le malate immédiatement après le pyruvate pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement pour définir l’événement correspondant.
   9. Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon, attendez la stabilisation du flux et enregistrez pendant environ 2 min.
   10. Ajouter l’adénosine diphosphate (ADP) à une concentration finale de 2,5 mM. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement pour définir l’événement correspondant.
   11. Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon, attendez la stabilisation du flux et enregistrez pendant environ 2 min.
       NOTE: Après l’ajout d’ADP, le flux peut continuer à augmenter lentement, prenant jusqu’à 20 minutes pour se stabiliser.
   12. Ajouter du cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP) par incréments de 0,5 μM pour atteindre le flux maximal. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement pour définir l’événement correspondant après chaque titrage.
       PRUDENCE: Le CCCP est toxique en cas d’ingestion.
       NOTE: Effectuez des titrages CCCP en série rapide (intervalles d’environ 1,5 minute). Arrêtez le titrage lorsque l’ajout ultérieur n’augmente pas davantage le flux. Modifiez le nom de chaque titrage CCCP dans la fenêtre d’événements en remplaçant * par la concentration cumulée CCCP.
   13. Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon et enregistrez pendant environ 2 min.
   14. Ajouter de l’antimycine A pour atteindre une concentration finale de 2,5 μM.
       PRUDENCE: L’antimycine A est mortelle en cas d’ingestion.
       NOTE: Le temps de réponse peut varier en fonction de l’échantillon.
   15. Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon et enregistrez pendant environ 2 min.
   16. Cliquez sur le bouton Arrêter la mesure.

4. Analyse des données

1. Analysez les données.
   1. Repères de réglage sur les sections stables et représentatives du diagramme de flux.
      NOTE: Évitez d’inclure des artefacts de titrage dans l’analyse des traces (Figure 2B).
2. Sélectionnez Repères dans le menu supérieur, puis choisissez Statistiques de repères. Sélectionnez le mode de statistiques souhaité et cliquez sur Copier dans le presse-papiers pour transférer les données pour une analyse plus approfondie.

Graphique 1 : Respirométrie à haute résolution des cellules HEK 293T. Trace de la concentration en O2 [μM] (lignes bleues) et du flux d’O2 spécifique au volume [pmol∙s-1∙mL-1] (lignes rouges ; corrigée pour le flux O2 de fond instrumental ; les pics causés par les titrages ont été éliminés). SUIT-002_O2_ce-pce_D007 est un protocole étendu qui comprend l’ajout de cellules ce1, la respiration de routine R de cellules vivantes. +Creuser, digitonine 10 μg·mLL-1 ; Perméabilisation des membranes plasmiques (CE à PCE), respiration endogène résiduelle ren. +D, ADP 2,5 mM stimulant la consommation résiduelle de substrat endogène. +M.1, malate 0,1 mM et 1Oct, octanoylcarnitine 0,5 mM ; capacité OXPHOS de la voie F, 1c, cytochrome c 10 μM ; test d’intégrité de la membrane externe mitochondriale, 2M2, malate 2 mM soutenant la voie N anaplérotique ; F(N)P. 3P et 4G, pyruvate 5 mM et glutamate 10 mM, activation progressive en FNP. 5S, succinate 10 mM, FNSP. 6Gp, glycérophosphate 10 mM, FNSGpP. 7U4.5, titrage du découpleur à la concentration optimale CCCP 4,5 μM ; FNSGpE. 8Rot, roténone 0,5 μM SGpE. 9Ama, antimycine A 2,5 μM, rox. 10AsTm, ascorbate 2 mM et TMPD 0,5 mM, O2 flux hors échelle 121 pmol·sL-1·mLL-1. 11Azd, azoture 200 mM, fond chimique chb. Concentration cellulaire 1 million par mL, milieu MiR05, température 37 °C. La concentration en oxygène a été maintenue au-dessus de 60 μM par des réoxygénations intermittentes (air, chambre ouverte, teinte bleue).

Graphique 2 : Protocole simplifié de titrage substrat-découplage-inhibiteur (SUIT) avec des cellules HEK 293T pour mettre en évidence le moment approprié des titrages chimiques. (A) montre les pointes causées par les titrages, qui sont supprimées dans (B). Traces superposées de flux O2 par volume [pmol∙s-1∙mL-1] pour la chambre A (ligne magenta) et la chambre B (ligne verte). Addition de cellules (ce1) et mesure de la respiration de routine R. +Creuser, titrer la digitonine 5 μg·mL-1 pour perméabiliser la membrane plasmique (ce à pce) et mesurer la respiration endogène résiduelle ren. 1PM, addition dans la séquence proche de pyruvate (5 mM) et de malate (2 mM) pour stimuler la voie N. 2D, ajout de l’ADP 2,5 mM ; N-voie OXPHOS capacité NP. 3U5, titrage rapide du découplage par pas de 0,5 μM jusqu’à la concentration optimale CCCP ; Capacité ET liée au NADH NE. 4Ama, titrage de l’antimycine A 2,5 μM pour évaluer la consommation résiduelle d’oxygène. Concentration cellulaire 1 million/mL, milieu MiR05, température 37 °C