Cytométrie en flux photoacoustique in vitro : une technique photoacoustique en flux non invasive pour détecter les cellules cancéreuses de l’ovaire circulantes contenant des nanoparticules

Architecture du système >Flow

1. Construction de la chambre d’écoulement

1. À l’aide du fichier Solid Works fourni, imprimez en 3D le réservoir d’écoulement à l’aide de thermoplastique ABS ou de plastique PLA. Les cotes sont indiquées ci-dessous si SolidWorks n’est pas disponible. La figure 1A montre une représentation de ce modèle. Le corps du réservoir d’écoulement mesure 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Les extrémités du réservoir d’écoulement comportent des trous d’environ 5 mm de diamètre pour permettre l’entrée du tube contenant le tube capillaire.
   note: Le réservoir d’écoulement dispose d’un trou de 1 cm, perpendiculaire à l’orientation du tube capillaire, pour le placement du transducteur à ultrasons. Une extrusion cylindrique du même diamètre intérieur que le trou s’étend sur 6 mm dans le réservoir. Pour l’imagerie en temps réel, le réservoir d’écoulement dispose d’une fente de 1 mm x 3 mm directement sous le tube capillaire.
2. Après avoir imprimé le réservoir d’écoulement 3D, nettoyez et assemblez le système pour l’utiliser.
3. Placez les lamelles en verre sur la fente de 1 mm x 3 mm et le trou de 1 cm dans le système d’écoulement.
4. Scellez soigneusement avec du silicone pour éviter les fuites.
5. Insérez le tube capillaire dans les tubes durcis en silicone. Insérez les tubes dans la chambre d’écoulement par le côté du réservoir d’écoulement de sorte que le tube capillaire en verre se trouve directement au-dessus et devant la fente de 3 mm et le trou de 1 cm.
6. Scellez le tube à l’aide de silicone pour éviter les fuites.

2. Configuration du système d’écoulement photoacoustique

REMARQUE : Les figures 1B et 1C montrent un exemple d’architecture du système de flux.

1. Connectez le transducteur à un émetteur/récepteur à ultrasons. Amplifiez le signal avec un gain de 59 dB.
2. Connectez la sortie du filtre à un oscilloscope reconfigurable polyvalent équipé d’un réseau de portes programmables sur le terrain intégré.
3. Connectez l’un des tubes provenant de la chambre d’écoulement à une jonction en T, reliée à deux pousse-seringues à chaque branche.
4. Remplissez l’un des pousse-seringues d’air et l’autre pompe de l’échantillon à analyser. Réglez la pompe contenant l’air à un débit de 40 μL/min et la pompe ayant l’échantillon à un débit de 20 μL/min. L’écoulement diphasique résultant produira des volumes d’échantillon de 1 μL. À ce débit, le système testera environ 6,4 échantillons par minute.
   note: Pour maintenir une distribution uniforme des cellules, agitez légèrement chaque échantillon immédiatement avant d’être testé. De plus, tournez la seringue toutes les quelques minutes pour éviter que les cellules ne se déposent dans la solution.
5. Connectez le tube restant à la sortie du système d’écoulement à un récipient contenant 10 % d’eau de Javel, pour éliminer les cellules après leur sortie du système d’écoulement.
   note: Avant d’utiliser le système d’écoulement, vérifiez qu’il n’y a pas de fuites, car celles-ci peuvent affecter l’écoulement. Les cellules doivent être confinées dans un système fermé pour maintenir la sécurité biologique pendant la procédure.
6. La conception du réservoir imprimé en 3D permet un alignement cohérent et reproductible entre le transducteur et la lumière laser avec un étalonnage minimal. Lorsqu’il est correctement placé dans le réservoir personnalisé, le tube capillaire en quartz garantit que le transducteur et le laser sont directement alignés.
7. Placez la section du tube capillaire en quartz dans l’alignement direct avec le transducteur, dans le champ de vision du microscope, en permettant un placement soigneux de la fibre optique au-dessus de l’échantillon de sorte qu’elle éclaire toute la largeur du tube.
8. Irradiez l’échantillon à l’aide d’une fibre optique canalisant un laser à semi-conducteurs pompé par diode fonctionnant à une longueur d’onde de 1 053 nm. La lumière laser incidente sur l’échantillon et le transducteur utilisé pour mesurer l’effet photoacoustique sont tous deux non focalisés.
9. L’énergie de l’incident laser sur l’échantillon est d’environ 8 mJ et la fréquence laser de 10 Hz est suffisante pour éclairer chaque échantillon plusieurs fois lors de son passage dans le système.
10. Placez le système d’écoulement sur un microscope inversé et assurez-vous que l’impulsion laser et le chemin de l’échantillon sont visibles lorsque l’échantillon passe dans le système d’écoulement. Enregistrez le débit à l’aide d’une caméra montée sur microscope.
11. Enregistrez les acquisitions d’échographes à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données. Déclenchez des ultrasons et un laser pulsé à l’aide du FPGA. Utiliser du PBS avec 2 % de Tween et des NP de FA-CuS à une concentration de 100 μg/mL dans du PBS 2 % Tween, comme témoins négatifs et positifs, respectivement.
12. À l’aide d’une caméra montée sur microscope, enregistrez à la fois le tir du laser et le passage des échantillons dans le système d’écoulement. Ces enregistrements seront utilisés pour corréler le signal acoustique enregistré par le transducteur avec le tir du laser. Lorsque les échantillons passent devant le tir du laser, le signal peut alors être corrélé au signal photoacoustique résultant pour l’analyse. À une fréquence d’échantillonnage de 10 Hz, le laser éclairera chaque prise plusieurs fois.