Essai de transplantation de coussinet adipeux ovarien : une technique in vivo pour introduire des cellules dans le coussinet adipeux ovarien dans des modèles murins

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Transplantation de coussinets adipeux ovariens

NOTE : Désinfecter les instruments entre chaque chirurgie animale. Préparez et disposez tout l’équipement à l’avance. Les transplantations dorsales sur le coussinet adipeux de l’ovaire droit sont préférentielles car elles évitent la rate. Cependant, les receveurs peuvent avoir des greffes dans les deux coussinets adipeux ovariens.

1. Utiliser des souris syngéniques ou des souris immunodéficientes combinées sévères (SCID/NCr) comme receveurs de cellules primaires. Pour les cellules humaines, telles que les cellules HIO118, utilisez des souris Nod/SCID/gamma (NSG) ou des souris SCID.
2. Anesthésier la souris receveuse à l’aide d’une injection intrapéritonéale unique de 2,2,2-tribromoéthanol à la dose de 0,15 mL/10 g de poids corporel. Placez l’animal sur un coussin chauffant dans la capuche de l’animal et confirmez la bonne anesthésie par perte de réflexe de pédale (pincement des orteils). Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant que l’animal est sous anesthésie. Injecter par voie sous-cutanée à l’animal l’analgésique kétoprofène à une dose de 4 mg/g de poids corporel pour traiter la douleur post-chirurgicale.
   NOTE : Comme alternative, utilisez l’isoflurane pour l’anesthésie. Placez l’animal dans la chambre d’induction et ajustez le débitmètre d’oxygène à 0,8-1,5 L/min et le vaporisateur d’isoflurane à 2-3 %. Retirez l’animal anesthésié de la chambre, laissez-le respirer de l’isoflurane à partir d’un masque et réglez le débitmètre d’oxygène sur 0,4-0,8 L/min et le vaporisateur d’isoflurane sur 1,5 %, puis commencez l’opération.
3. Rasez la zone chirurgicale avec une tondeuse #40, retirez les poils d’un site deux fois la zone chirurgicale, préparez la peau rasée avec trois gommages antiseptiques de povidone iodée, suivis de 70 % d’éthanol, et couvrez avec un champ stérile.
4. Placez l’animal sous un microscope de dissection situé dans une armoire de biosécurité. Exposez l’appareil reproducteur par une incision en position dorsomédiale directement au-dessus du coussinet adipeux ovarien.
   ÉTAPE CRITIQUE : L’incision précise de la peau facilite la cicatrisation des plaies ; L’utilisation d’un scalpel est recommandée à l’étape 1.4.
5. À l’aide d’une pince fine et émoussée, tirez délicatement le coussinet adipeux ovarien à travers l’incision vers la ligne médiane, minimisant ainsi les dommages aux nerfs et aux principaux vaisseaux sanguins.
   ÉTAPE CRITIQUE : En cas de saignement, arrêtez la chirurgie et envisagez la transplantation sur un autre animal hôte.
6. Sous le contrôle du microscope de dissection à l’aide d’une aiguille biseautée de calibre 28, faites une incision de 2 à 4 mm de profondeur dans le coussinet adipeux de l’ovaire, à 3-4 mm au-dessus de l’ovaire.
   ÉTAPETECHNIQUE : Assurez-vous que l’incision ne passe que par la moitié du coussinet adipeux ; La perforation jusqu’à la face inférieure provoque des fuites. Soyez rapide et procédez sans délai après cette étape.
7. Pour les greffes de cellules, remplissez une seringue (aiguille de calibre 30) avec 10 à 20 μL du mélange de matrice de membrane cellule-basale et injectez-la dans l’incision du coussinet adipeux. Pour la greffe de trompe utérine, prenez la trompe utérine à l’aide d’une pince fine et placez-la dans une matrice de membrane basale de 10 à 20 μL maintenue sur de la glace. À l’aide d’un embout filtrant gradué XL de 0,1-10/20 μL (raccourci de 3 mm), prélevez la suspension de la matrice du tissu et de la membrane basale et relâchez-la dans l’incision du coussinet adipeux.
8. Attendez 5 minutes que la matrice de la membrane basale se solidifie et replacez l’appareil reproducteur dans le péritoine. Fermez les muscles avec deux points de suture chirurgicale et la peau avec deux petits clips de plaie ou des sutures chirurgicales.
9. Répétez les étapes 1.4-1.8 pour transplanter un mélange de matrice de membrane PBS-basale dans le coussinet adipeux controlatéral de l'animal, qui servira de témoin.
   ÉTAPE CRITIQUE : Après la chirurgie, placez l’animal sur un coussin chauffant car la perte de chaleur est rapide chez les souris anesthésiées.
10. Laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant dans la cage d’origine et observez-le jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé de l’anesthésie. Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
11. Placez une poignée de granulés de nourriture pré-mouillée à l’intérieur de la cage en plus de la nourriture sèche sur la cage après la chirurgie. Appliquez des analgésiques post-chirurgicaux si nécessaire pendant les prochains jours et examinez la plaie quotidiennement. Appliquez des antibiotiques selon le protocole animal approuvé en cas d’infection de la plaie. Retirez les clips de plaie dix jours après l’opération lorsque la plaie est complètement refermée.