Inoculation orthotopique de cellules cancéreuses de l’ovaire dans l’ovaire murin : une procédure pour établir un modèle murin de cancer de l’ovaire pour étudier la dissémination péritonéale des cellules

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des suspensions cellulaires

1. Lignée cellulaire de carcinome à cellules claires de l’ovaire humain
   1. Maintenir les cellules ES-2 dans le milieu RPMI-1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de pénicilline/streptomycine (pénicilline : 100 unités/mL, streptomycine : 0,1 mg/mL). Cellules de culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂.
   2. Prélever des cellules en phase de croissance logarithmique dans une solution de trypsine à 0,05 % et d’EDTA à 0,02 % (trypsine/EDTA).
      1. Tout d’abord, retirez l’ancien milieu du récipient de culture cellulaire, puis lavez les cellules une fois avec du PBS (PBS sans Ca²⁺/Mg²⁺,3-4 mL par 25 cm²).
      2. Ensuite, ajoutez 1 mL par 25 cm² de trypsine/EDTA. Faites pivoter le récipient de culture cellulaire pour couvrir la monocouche cellulaire de trypsine/EDTA. Après avoir retiré et jeté la trypsine/EDTA, remettez le récipient de culture cellulaire dans l’incubateur pendant 3 à 5 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se détachent.
      3. Examinez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont détachées de la surface du récipient de culture cellulaire et qu’elles flottent.
      4. Ajouter un milieu de croissance frais contenant du sérum pour inactiver la trypsine (5 mL par 25^cm2) et remettre les cellules en suspension. Transférez les cellules remises en suspension dans un tube conique de 15 ml.
      5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Effectuer la centrifugation à 4 °C ou à température ambiante. Retirer délicatement les cellules surnageantes et les remettre en suspension avec du milieu de croissance (5 mL par 25^cm2).
   3. Compter les cellules (p. ex., par exclusion du bleu de trypan), puis les remettre en suspension dans le milieu de croissance à une densité de 2 x 10⁸ cellules/mL. Mettez les cellules suspendues sur de la glace.
2. Décongeler des aliquotes d’hydrogel congelées à base de matrice extracellulaire (MEC) dans un bain de glace.
3. Ajouter la suspension cellulaire aux aliquotes d’hydrogel à base d’ECM dans un rapport de 1:1 (concentration cellulaire finale : 1 x 10⁵ cellules/μL d’hydrogel à base d’ECM moyenne) et bien mélanger. Placez les suspensions cellulaires préparées dans un bain de glace jusqu’à utilisation.

2. Inoculation orthotopique avec des suspensions cellulaires

REMARQUE : La chirurgie ne nécessite pas de suite dédiée. La chirurgie peut être effectuée sur une paillasse de laboratoire dans une zone de la pièce qui est séparée et où l’activité est minimale. Une capuche laminaire peut également être utilisée. Des instruments chirurgicaux stériles doivent être utilisés et des ciseaux ne doivent pas être utilisés pour faire des incisions cutanées.

1. Utilisez des souris nues femelles (BALB/c nu/nu) à l’âge de 8 semaines pour ce modèle d’inoculation orthotopique.
2. Tout d’abord, anesthésier la souris par inhalation avec de l’isoflurane (2-4 %). Vérifiez la profondeur de l’anesthésique en vérifiant l’absence de retrait lors d’un pincement ferme de l’orteil. Une fois la souris anesthésiée, appliquez une pommade ophtalmique stérile fade sur les yeux pour éviter le dessèchement si nécessaire.
3. Placez la souris anesthésiée sur une platine d’opération, côté ventre vers le bas. Désinfectez la zone chirurgicale plusieurs fois avec de l’alcool et un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine.
4. Faites une incision verticale de 2 cm près de la colonne vertébrale entre l’arc costal droit et le fémur. Utilisez un champ chirurgical stérile autour du site d’incision. Fixez les surfaces cutanées incisées à l’aide de pinces pour maintenir l’ouverture.
   note: Des écarteurs peuvent être utilisés à la place des pinces.
5. Ensuite, faites une deuxième incision (environ 1 cm) au niveau du péritoine pariétal sous la première incision pour ouvrir la cavité abdominale. Clamp les surfaces abdominales incisées. Coupez le tissu adipeux qui entoure l’ovaire ipsilatéral et la trompe de Fallope avec une pince pour retirer l’ovaire de la cavité abdominale. Placez soigneusement l’ovaire et la trompe de Fallope sur de la gaze. Ensuite, placez la souris côté ventre vers le bas sous le microscope à dissection.
6. Placez la suspension cellulaire dans une seringue à insuline (1/2 cc, 29 G) juste avant l’injection. Injectez avec précaution la suspension cellulaire préparée (1-2 μL) dans l’ovaire. Pendant plusieurs secondes, maintenez l’aiguille à l’intérieur de l’ovaire pour assurer la gélification de l’hydrogel à base d’ECM. Après la gélification, les cellules tumorales injectées restent à l’intérieur de l’ovaire.
7. Remettez soigneusement l’ovaire dans le corps. Suturez la deuxième incision avec de la soie médicale stérile, puis scellez la peau avec des pinces à plaie.
8. Après la chirurgie, les souris recevront un analgésique (p. ex., méloxicam, intramusculaire ou sous-cutané, 0,2 mg/kg) pendant la période initiale de 24 heures.