Injection intraveineuse de cellules cancéreuses dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïde du poulet : une procédure pour établir un modèle de cancer de la membrane chorioallantoïde pour étudier l’invasion du cancer et les métastases

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des cellules cancéreuses pour l’injection

REMARQUE : La sélection des colonies métastatiques est basée sur un phénotype établi par des cellules cancéreuses fluorescentes, dérivé d’une bibliothèque d’expressions ou d’un vecteur marqué avec une protéine fluorescente telle qu’une protéine fluorescente verte ou rouge (voir l’ensemble du flux d’écran dans la Figure 1A). Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules transfectées transitoirement avec des protéines fluorescentes ou marquées avec des colorants fluorescents perméables aux cellules en raison de l’affaiblissement rapide du signal causé par la prolifération des cellules cancéreuses et la coloration inégale.

1. Cultivez des cellules cancéreuses à une confluence de 60 à 70 % au moment de l’injection. L’utilisation de cellules cancéreuses à des niveaux de confluence plus élevés diminuera leur viabilité, ce qui entraînera une faible efficacité de la formation de colonies métastatiques. Assurez-vous que les cellules cancéreuses utilisées sont exemptes de mycoplasmes, car la contamination par les mycoplasmes peut entraîner une diminution de la viabilité des embryons de poulet.
2. Rincez les cellules deux fois avec 1x PBS, pH 7,4. Retirez le PBS restant, puis ajoutez 0,5 % de trypsine-EDTA et incubez à 37 °C pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce que toutes les cellules soient retirées de la surface de la boîte de culture.
3. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger les cellules à température ambiante à 200 x g pendant 5 min.
4. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de PBS et les centrifuger à nouveau comme à l’étape 1.3, pour éliminer la trypsine et d’autres composants du milieu de culture tels que les antibiotiques.
   note: La présence de trypsine ou de composants de culture cellulaire tels que des antibiotiques dans la suspension de cellules cancéreuses peut entraîner une diminution de la viabilité de l’embryon de poulet.
5. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 1 mL de PBS glacé.
6. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou de tout autre appareil de comptage cellulaire disponible.
   note: Ce protocole de dépistage exige que chaque colonie métastatique soit initiée par une seule cellule. Lors du comptage des cellules, assurez-vous qu’elles sont complètement trypsinisées et qu’elles existent sous forme de suspension cellulaire unique (il n’y a pas d’amas de cellules).
7. Pour l’injection intraveineuse (IV), concentrer les cellules à 0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ cellules/mL. Utilisez du PBS 1x glacé pour diluer et/ou remettre en suspension les concentrés cellulaires. Attendez-vous à ce qu’environ 1 ml de suspension cellulaire soit nécessaire pour dix embryons.
   note: La concentration nécessaire en suspension cellulaire en suspension est principalement déterminée par le niveau d’expérience de l’expérimentateur. Veuillez consulter la section suivante pour plus de détails.

2. Injection intraveineuse de cellules cancéreuses pour la formation de colonies métastatiques

REMARQUE : En suivant ce protocole, jusqu’à cent embryons peuvent être injectés en une journée. Il faut généralement plus de temps pour isoler les colonies métastatiques que pour injecter les cellules cancéreuses et, par conséquent, il est recommandé d’effectuer une première expérience pour estimer le temps nécessaire pour réaliser toutes les étapes. L’utilisation de marqueurs fluorescents différentiels pour cellules cancéreuses permet de réduire le nombre d’animaux et le temps nécessaire à chaque expérience. Par exemple, les cellules témoins peuvent être marquées avec RFP (protéine fluorescente rouge) tandis que les cellules tumorales mutantes peuvent être alternativement marquées avec GFP (protéine fluorescente verte). Dans ce cas, chaque expérience dispose d’un contrôle intégré qui corrige la variabilité inter-embryonnaire.

1. Assemblez l’appareil d’injection comme indiqué sur la figure 1B. Tout d’abord, montez une aiguille sur la seringue, puis étendez l’aiguille de la seringue avec un morceau de tube de 3 à 5 cm de long.
2. Cassez la pointe de l’aiguille en borosilicate à l’aide de la pince fine (~20 à 60 μL de large).
3. Chargez la seringue avec la suspension de cellules cancéreuses (50 à 200 μL) et insérez l’aiguille en borosilicate dans la tubulure (figure 1B).
4. Inspectez l’aiguille borosilicate pour détecter l’obstruction des cellules et la présence de bulles d’air. Il est essentiel d’injecter des cellules sous forme de suspension cellulaire unique pour s’assurer que chaque colonie métastatique est initiée par une seule cellule.
   note: Les cellules cancéreuses ont tendance à s’agréger en PBS dans les 1 à 2 heures suivant la trypsinisation et, par conséquent, doivent être préparées immédiatement avant l’injection. Si nécessaire, les cellules peuvent être remises en suspension périodiquement à l’aide de la seringue de 1 mL utilisée pour les injections (sans l’aiguille borosilicatée).
5. Si un colmatage cellulaire est observé dans le capillaire, retirez le capillaire, remettez les cellules en suspension et remplacez-le par un nouveau capillaire. Utilisez le piston pour repousser les bulles. Si aucun colmatage de cellule ou bulle n’est observé, passez à l’étape suivante.
6. Retirez le couvercle et transférez l’embryon sous le stéréoscope. Identifiez la veine appropriée à injecter sur la surface CAM. Les veines et les artères forment le réseau complexe dans le tissu CAM (Figure 1C). Les veines se distinguent par leur couleur rouge plus brillante car elles transportent du sang riche en oxygène vers l’embryon.
   note: Pour la manipulation générale d’embryons, l’injection de cellules cancéreuses et l’excision de colonies métastatiques, utilisez un stéréomicroscope fluorescent équipé d’objectifs 0,8x et 1,5x et d’oculaires 10x pour la visualisation. Des microscopes moins avancés peuvent également être utilisés avec succès pour ces procédures, en fonction du niveau d'expérience de l'utilisateur. Les lecteurs peuvent contacter les auteurs pour des recommandations plus détaillées.
7. Trouvez la veine idéale pour injecter des cellules qui n’est normalement que légèrement plus large (10 à 20 %) que le diamètre de l’extrémité de l’aiguille en borosilicate et située à mi-chemin entre l’embryon et la paroi de la boîte de pesée. Il est généralement plus facile d’injecter au point immédiatement adjacent à la bifurcation veineuse.
   note: L’injection dans une veine plus grosse peut sembler plus facile, mais entraînera des saignements excessifs et une diminution de la survie embryonnaire.
8. Appuyez la pointe de l’aiguille contre la paroi du vaisseau sanguin et appliquez une légère pression dans le même sens que le flux sanguin. Si nécessaire, utilisez un coton-tige (tenu dans l’autre main) pour aider à ancrer ou à stabiliser le récipient qui est injecté.
9. Appuyez doucement sur le piston de la seringue. On peut visualiser une injection réussie en observant un « dégagement » du vaisseau sanguin lorsque la suspension de cellules cancéreuses pénètre dans la circulation sanguine.
10. Continuez à enfoncer le piston de la seringue pendant 2 à 10 s jusqu’à ce que le volume de suspension souhaité soit injecté dans la circulation sanguine de la veine. Au total, l’injection d’un seul embryon peut prendre de 1 à 10 minutes selon le niveau d’expérience de l’utilisateur. En cas de saignement excessif ou d’accumulation de liquide clair au point d’injection, jetez l’embryon.
    note: Il est facile de « surinjecter » un embryon. La considération générale à garder à l’esprit est que les colonies métastatiques ne doivent pas se toucher après une période de croissance de 4 à 5 jours. Idéalement, ~5 à 10 % des capillaires terminaux de la veine CAM devraient avoir des cellules immobilisées après une injection réussie (Figure 1D, E). Comme mentionné dans la section 1, une gamme de concentrations cellulaires peut être utilisée (0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ cellules/mL). Des concentrations plus faibles nécessiteront un temps d’injection plus long, mais diminueront le colmatage de l’aiguille. Des concentrations plus élevées nécessiteront des temps d’injection plus courts, mais augmenteront le colmatage de l’aiguille. Il est recommandé d’essayer plusieurs concentrations pour trouver celle qui est la plus confortable pour un opérateur. Généralement, une concentration plus élevée (1,0 x 10⁶ cellules/mL) est préférée pour réduire le temps d’injection.
11. Retirez l’aiguille du CAM et tamponnez doucement le site d’injection avec un coton-tige pour éliminer tout sang ou cellules cancéreuses en excès.
12. Couvrez l’embryon dans la boîte de pesée avec un couvercle et remettez l’embryon de poulet injecté dans l’incubateur.
13. Répétez la procédure avec l’embryon suivant jusqu’à ce que tous les embryons soient injectés.