Test de ramification du glycogène pour mesurer le degré de ramification du glycogène

1. Évaluation qualitative de la ramification du glycogène

1. Préparez une solution saturée de chlorure de calcium en ajoutant 74,5 g de chlorure de calcium anhydre à ~40 mL d’eau et en agitant. Ajoutez un peu plus d’eau et continuez à remuer. Augmentez le volume à 100 ml avec de l’eau et continuez à remuer jusqu’à ce que le CaCl₂ soit complètement dissous.
2. Préparez un stock de travail de réactif colorant iode/CaCl₂ en mélangeant 50 μL de solution mère de KI/iode avec 13 mL de solution saturée de CaCl₂ dans un tube de 15 mL. Bien mélanger et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable pendant au moins 1 semaine dans ces conditions.
3. Détermination de la ramification
   1. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 650 μL de réactif de couleur iode/CaCl₂ avec 100 μL d’eau et bien mélanger. Transférez la solution dans une cuvette en méthacrylate jetable.
      note: La solution dans la cuvette doit être claire et de couleur jaune pâle.
   2. Placez-le dans le spectrophotomètre et, en mode de balayage de longueur d’onde, collectez un spectre de fond de 330 nm à 800 nm.
   3. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger 650 μL de réactif colorant iode/CaCl₂ de travail avec 50 μg de glycogène d’huître. Porter le volume final à 750 μL avec de l’eau et bien mélanger. Transférez la solution dans une cuvette en méthacrylate jetable.
      note: La solution dans la cuvette doit être claire et d’une couleur orange/brun foncé.
4. Placez-le dans le spectrophotomètre et collectez un spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm.
5. Répétez les étapes 1.3.3 à 1.4 avec 50 μg d’amylopectine et 30 μg d’amylose.
   note: L’échantillon d’amylopectine doit être jaune/vert et l’échantillon d’amylose doit être vert/bleu. Les deux échantillons doivent être clairs. Les complexes colorés formés sont stables, sans modification du spectre d’absorption, pendant au moins 1 h à température ambiante.
6. Pour obtenir une indication de la structure ramifiée d’un échantillon de glycogène non caractérisé, combinez 25 μg à 50 μg de glycogène avec 650 μL de réactif de couleur iode/CaCl₂ de travail. Procéder comme ci-dessus, en portant le volume à 750 μL avec de l’eau, en mélangeant soigneusement et en transférant dans une cuvette en méthacrylate.
   note: L’échantillon de glycogène doit donner une couleur jaune/orange à orange/brun en fonction du degré de ramification (longueur des chaînes externes) du glycogène présent. Encore une fois, l’échantillon doit être clair.
7. Collectez le spectre d’absorption.