Candida albicans Formation d’un biofilm dans un modèle murin in vivo

1. Croissance de C. albicans

1. Vingt-quatre heures avant le début de l’expérience sur l’animal, préparer des plaques d’extrait de levure peptone dextrose, YPD en ajoutant 10 g d’extrait de levure granulé, 20 g de peptone bactériologique et 15 g de gélose granulée. Volume de maquillage à 900 ml avec de l’eau Milli-Q et de l’autoclave.
2. Ajouter 50 ml de glucose stérile à 40 %. Bien mélanger et verser dans des boîtes de Pétri. Laisser refroidir et solidifier les plaques de gélose.
   note: Dans cette étude, utilisez deux souches, à savoir la souche sauvage C. albicans SC5314 –gLuc négative (appelée WT) et la souche SKCA23 de C. albicans, qui est un type sauvage C. albicans SC5314 transformé avec le plasmide 22 Clp10 ::Act1p-gLUC59. Dans cette souche (nommée SKCA23-ACTgLuc), gLuc a été fusionné avec le gène endogène PGA59 sous le contrôle du promoteur ACT1 (actine) (ce promoteur est actif dans la levure, ainsi que dans le stade hyphe de croissance fongique). Cette souche peut être demandée au laboratoire du Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgique. Le plasmide Clp10 ::Act1p-gLUC59 plasmide 22 a été gracieusement offert par le Prof. C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, France.
3. Conservez les deux souches dans un stock de glycérol et conservez-les à -80 °C.
4. Avant toute expérience, les souches de traînée se déposent sur une plaque YPD. Incuber la plaque à 37 °C pendant la nuit.

2. Préparation des pièces de cathéter

1. Avant l’expérience, déterminez le nombre de cathéters nécessaires. Il est possible d’implanter jusqu’à 6 pièces de cathéter par souris (3 cathéters à gauche et 3 cathéters à droite de l’animal (Figure 1A).
2. Vingt-quatre heures avant la chirurgie animale, ouvrez l’emballage contenant le cathéter à triple lumière sous l’enceinte de sécurité biologique. Retirez toutes les parties inutiles à l’aide d’une pince à épiler stérile et coupez la partie attachée au cathéter à l’aide d’un scalpel stérile. Placez la règle sous l’emballage en plastique et coupez des morceaux de cathéter en polyuréthane d’exactement 1 cm selon l’échelle de la règle (Figure 2).
   note: Il est important de mentionner que ce type de pièce de cathéter n’est pas phosphorescent et convient donc au BLI.
3. Placez un maximum de 15 morceaux de cathéter coupés (étape 2.2) dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml. Préparez toujours 3 morceaux supplémentaires, qui sont utilisés pour énumérer la quantité de cellules Candida attachées sur l’appareil après la période d’adhésion.
4. Complétez les cathéters avec environ 1,8 ml de sérum de veau fœtal à 100 %.
5. Vortex vigoureusement et ajoutez 100 à 200 μl supplémentaires de 100 % FBS. Couvrez complètement tous les morceaux du cathéter avec du sérum.
6. Incuber à 37 °C pendant la nuit.

3. Adhérence ex vivo de C. albicans sur des substrats en polyuréthane revêtus de FBS

1. Transférez chaque pièce de cathéter recouverte de sérum dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
2. Grattez quelques cellules de C. albicans cultivées sur des plaques YPD (étape 1) et suspendez-les dans 1 ml de PBS.
3. Diluez les cellules de Candida (1:100) dans un tube de microcentrifugation séparé. Prélever 10 μl de l’échantillon dilué et l’appliquer dans une chambre de comptage de cellules. Comptez au moins 16 petits carrés.
4. Préparez des cellules de Candida (chaque souche séparément) dans un milieu RPMI 1640 jusqu’à une concentration finale de 5 x 10⁴ cellules/ml.
5. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chaque pièce de cathéter recouverte de sérum.
6. Tourbillonnez vigoureusement et assurez-vous que les cathéters sont immergés dans le milieu et ne flottent pas sur le dessus.
7. Incuber les cathéters à 37 °C pendant 90 min (période d’adhérence).
8. Retirez les cathéters à l’aide d’une pince à épiler stérile et lavez-les deux fois avec 1 ml de PBS. Au cours de cette étape, assurez-vous que le liquide de lavage traverse la lumière en maintenant le cathéter en position verticale tout en rinçant très doucement le cathéter. Il est important de ne pas utiliser un flux fort qui pourrait entraîner l’élimination des cellules attachées.
9. Transférez chaque cathéter lavé dans un tube de microcentrifugation propre (un morceau par tube).
10. Placer sur de la glace et y conserver jusqu’à l’opération.

4. Anesthésie

1. Préparez l’anesthésie en mélangeant 75 μl de kétamine (100 mg/ml) avec 100 μl de médétomidine (1 mg/ml) et 825 μl de solution saline stérile. Administrer par voie intrapéritonéale (i.p.) 60-80 μl de cocktail anesthésique par 10 g de poids corporel, ce qui donne une dose de 45-60 mg/kg de kétamine et de 0,6-0,8 mg/kg de médétomidine.
2. Pour inverser l’anesthésie, diluer 50 μl d’atipamézole (5 mg/ml) dans 4,95 ml de solution saline, et administrer 100 μl par 10 g de poids corporel comme antidote, ce qui donne une dose de 0,5 mg/kg.
3. Après l’injection de l’anesthésie, placez l’animal dans une cage séparée et attendez qu’il soit complètement endormi.
4. Confirmez l’anesthésie correcte de l’animal par un léger pincement de la peau et des orteils, qui ne causent aucun dommage à la peau. Tout mouvement observé indique que l’animal n’est pas suffisamment anesthésié pour effectuer une intervention chirurgicale. Si cela se produit, attendez quelques minutes de plus jusqu’à ce que l’animal ne montre aucun signe de mouvement sur la peau ou de pincement des orteils.

5. Chirurgie animale

1. Transférez l’animal anesthésié hors de la cage sur un mouchoir propre placé sur le coussin chauffant, préchauffé à 37 °C (Figure 1A).
   note: Une alternative moins chère consiste à utiliser des couvertures chauffantes électriquement. Il est également possible d’utiliser des coussinets isothermiques, qui doivent être réchauffés au micro-ondes avant la chirurgie animale.
2. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
3. Rasez le bas du dos de l’animal avec un rasoir électrique. Retirez tous les poils d’animaux et transférez-les dans un mouchoir propre. Désinfectez la peau (p. ex. avec de l’isopropanol à 1 % d’iode ou de la chlorhexidine à 0,5 % dans de l’alcool à 70 %) et laissez sécher la zone désinfectée pendant environ 1 minute (figure 1A).
4. Faites une petite incision dans la peau (une à gauche et une à droite de l’animal) (environ 0,5 à 1 cm) (figure 1A).
5. Disséquez l’hypoderme à l’aide d’un ciseau pour créer deux tunnels sous-cutanés. Chaque tunnel doit mesurer environ 1,5 cm de long et 1 cm de large.
6. Insérez trois morceaux de cathéter, précédemment infectés par Candida, dans chaque tunnel. Assurez-vous que les cathéters sont placés l’un à côté de l’autre dans une disposition horizontale et qu’ils ne se recouvrent pas pour permettre l’implantation de six fragments de cathéter au total (Figure 1A).
7. Fermez les incisions avec des sutures. Vous pouvez également utiliser Dermabond pour fermer la plaie.
8. Désinfectez la plaie très doucement avec de la chlorhexidine à 0,5 % dans de l’alcool à 70 % ou de l’isopropanol iodé (1 %).
9. Appliquez un anesthésique local (gel de xylocaïne, 2 %) directement sur la plaie.
10. Administrer l’inversion de l’anesthésie (protocole 5, étape 2) : intrapéritonéale 100 μl pour 10 g de poids corporel.
11. Transférez l’animal dans une cage propre préalablement placée sur une plaque chauffante. Gardez l’animal séparé et au chaud jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé. Pendant ce temps, poursuivez l’opération et l’implantation de l’animal suivant. Une fois que tous les animaux opérés sont complètement réveillés. Transfert dans une cage. Surveillez régulièrement les animaux.

6. Imagerie par bioluminescence : préparation de la coelenterazine (CTZ), le substrat de G. princeps luciferase

1. Préparez une solution mère de coelenterazine fraîche (CTZ) en dissolvant 5 mg/ml de CTZ dans de l'éthanol acidifié ou selon les instructions du fabricant.
2. Préparer une solution de travail de 1,2 mM en diluant la solution mère 1:10 dans du PBS.
   REMARQUE : Injectez 100 μl de solutions de travail CTZ par voie sous-cutanée dans la zone entourant les cathéters. Utilisez des seringues à insuline pour l’injection sous-cutanée de CTZ.
3. Gardez toujours le CTZ dans l’obscurité (par exemple, couvrez les tubes de microcentrifugation contenant du CTZ avec du papier d’aluminium). Conserver la solution mère à -80 °C pendant toute la durée des expériences.

7. Imagerie par bioluminescence

1. Initialisez la caméra BLI.
2. Anesthésier les animaux à l’aide d’une boîte à induction. Utilisez un mélange gazeux d’isoflurane dans l’oxygène, N₂O/O₂, ou l’air à 2-3 %.
3. Après l’induction, maintenez l’anesthésie dans la boîte d’induction et la chambre d’imagerie à 1,5-2 %.
4. Avant de commencer la séance d’imagerie, placez la plaque d’imagerie en position A, qui correspond à un champ de vision, FOV de 10 cm. Assurez-vous de la bonne position des sorties d’anesthésie et de l’animal en plaçant un animal endormi dans le box.
5. Prenez quelques photos jusqu’à ce que l’animal soit dans la position d’imagerie souhaitée, dans le champ de vision juste sous l’appareil photo.
6. Préparez deux seringues à insuline contenant chacune 100 μl de la solution de travail CTZ.
7. Placez un animal sur le banc et maintenez-le endormi au moyen d’un cône nasal fournissant une anesthésie gazeuse.
8. Amenez les aiguilles des seringues à un endroit entourant les cathéters par voie sous-cutanée et injectez simultanément le CTZ sur le dessus des cathéters.
9. Immédiatement après l’injection, placez l’animal sur la plaque chaude dans le boîtier de la caméra et lancez l’acquisition de l’image par bioluminescence.
10. Acquérez des balayages consécutifs avec des temps d’acquisition allant de 20 à 60 secondes (selon l’intensité du signal) jusqu’à ce que l’intensité maximale du signal soit atteinte. Lors de l’acquisition de l’image suivante, mesurez l’intensité du signal BLI d’imagerie de bioluminescence des images précédemment acquises en plaçant un ROI sur chaque trio de cathéters et en mesurant le flux de photons à travers ce ROI.
11. Répétez l’opération à partir de l’étape 7 pour le ou les animaux suivants.
12. Après l’imagerie, remettez les animaux dans leur cage. Répéter l’IRB au cours d’une expérience de suivi longitudinal et non invasif de la formation du biofilm.
13. Analysez les données BLI à l’aide du logiciel Living Image. Placez un retour d’intérêt rectangulaire de taille fixe sur chaque trio de cathéters et mesurez le flux de photons (radiance) à travers chaque retour d’intérêt. Répétez cette opération pour chaque animal.
14. Indiquez l’intensité du signal BLI de chaque trio de cathéters sous forme de flux de photons par seconde. Représentez les données BLI sur une échelle logarithmique en traçant la moyenne et l’écart-type du flux de photons par seconde pour chaque groupe. Effectuez une analyse statistique sur les données transformées log10.

Figure 1 : Grandes étapes de la chirurgie animale. (A) La procédure d’implantation du cathéter. (1) Placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud contenant un mouchoir en papier et appliquez la pommade ophtalmique sur les yeux. (2) Rasez la partie inférieure du dos et désinfectez. (3) Créez deux petites incisions (environ 0,5 cm) à travers la peau à gauche et à droite du dos. Créez un tunnel sous-cutané à l’intérieur de chaque incision et placez 3 cathéters à l’intérieur. (4) Fermez la plaie avec des sutures et placez l’animal sur un coussin chaud pour récupérer. (B) Procédure de retrait du cathéter. (1) Placez l’animal sacrifié sur un tampon et désinfectez le côté opéré contenant les cathéters. Coupez la plaie juste au-dessus des cathéters. (2) Retirez délicatement chaque cathéter et lavez-le deux fois avec 1 ml de PBS. Placer dans le tube de microcentrifugation séparé.

Figure 2 : Préparation des dispositifs en polyuréthane. La partie en polyuréthane du cathéter est coupée en morceaux de 1 cm. La poche en plastique contenant le cathéter est ouverte dans des conditions stériles et toutes les pièces, à l’exception du cathéter, sont retirées de l’emballage. Deuxièmement, placez une règle sous la poche en plastique et coupez exactement des morceaux de polyuréthane de 1 cm. Ces dispositifs sont ensuite distribués dans des tubes de microcentrifugation (maximum 15 pièces/tube) et immergés dans du sérum de bovin fœtal à 100 %, suivis d’une nuit d’incubation à 37 °C.