Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Dissociation mécanique des tissus

REMARQUE : Gardez les cellules et les réactifs froids tout le temps, sauf pendant les étapes de coloration. Cette étape devrait prendre ~30 min.

1. Coupez chaque tissu cérébral à l’aide d’une lame de rasoir en^morceaux <1 mm 3 fins.
2. À l’aide d’une pipette de 1 mL (dont les pointes sont coupées), transvaser des morceaux de tissu dans les homogénéisateurs Dounce pré-refroidis, contenant chacun 2 mL de milieu A avec inhibiteur de DNase et de RNase.
3. Homogénéisez le tissu en tournant lentement le piston vers l’intérieur et l’extérieur de l’homogénéisateur Dounce pendant 6 à 10 coups complets jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux visibles.
   note: Le douncing tue les neurones et la plupart des autres cellules gliales, mais laisse les cellules microgliales plutôt intactes. Un rendement insuffisant et excessif peut entraîner un faible rendement en cellules.
4. Transférez les tissus dissociés dans des tubes de 50 mL à travers des passoires de 70 μm.
5. Rincez chaque homogénéisateur et piston Dounce avec un total de 6 mL de fluide froid A et filtrez la solution de rinçage à travers la même crépine dans le tube correspondant.
6. Transvaser les suspensions à cellule unique (environ 8 ml chacune) dans des tubes coniques de 15 ml et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C avec frein = 5.

2. Élimination de la myéline

REMARQUE : Cette étape devrait prendre ~60 min.

1. Préparez 1 grande colonne d’appauvrissement (LD) (pour le cortex) et 3 colonnes de grande sélection (LS) (pour les 3 autres régions) dans un séparateur magnétique (Table des matériaux). Rincez chaque colonne avec 3 ml de tampon MCS.
2. Une fois la centrifugation terminée, pipetez et jetez le surnageant sans déranger la pastille. Pour les tissus du cortex et du cervelet, remettre les cellules en suspension dans 850 μL de tampon MCS avec 1,8 μL d’inhibiteur de RNase. Pour les tissus de l’hippocampe et du striatum, remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon MCS avec 0,9 μL d’inhibiteur de RNase.
   note: Les colonnes (LD vs. LS) et le volume utilisé pour la remise en suspension sont optimisés en fonction de la quantité de myéline présente dans le tissu. Si d’autres régions du cerveau sont testées, ces conditions peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille du tissu et de la quantité de myéline qui peut exister. L’efficacité de l’élimination de la myéline peut être estimée à l’étape 2.9.
3. Ajoutez 100 μL de billes d’élimination de la myéline dans les cellules du cortex et du cervelet et ajoutez 50 μL de billes d’élimination de la myéline dans les cellules de l’hippocampe et du striatum.
4. Mélangez délicatement les cellules avec des billes et incubez les tubes sur de la glace pendant 10 min.
5. Porter le volume du tube avec les cellules corticales à 2 mL avec le tampon MCS et tous les autres à 1 mL (c.-à-d. ajouter 1 mL pour les cellules corticales ; 500 μL pour les cellules de l’hippocampe et du striatale ; pas besoin d’ajouter de tampon aux cellules cérébelleuses).
6. Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçage, placez un tube de 15 ml sous chaque colonne. Chargez les cellules corticales (2 ml) sur la colonne LD et toutes les autres (1 ml chacune) sur les colonnes LS. Utilisez immédiatement 1 mL de tampon MCS pour laver les tubes d’origine et chargez la solution sur les colonnes correspondantes.
7. Lavez une fois la colonne LD avec 1 ml de tampon MCS et lavez chaque colonne LS deux fois avec 1 ml de tampon MCS à chaque lavage. Continuez à recueillir la solution à écoulement continu pendant le lavage.