Génération d’un explant ganglionnaire racinaire dorsal et d’une culture cellulaire dissociée

1. Explant la culture de DRG d’une souris adulte

1. Placez le DRG recueilli dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant 3 ml de milieu glacé sans sérum (SFM).
2. Transférez chaque DRG individuel dans une boîte de Pétri en verre sec et, sous un microscope chirurgical, nettoyez et coupez les fibres en excès et le tissu conjonctif encore attachés au DRG à l’aide d’une lame. Le DRG est facilement identifiable comme une structure transparente bombée le long du nerf/racine de la colonne vertébrale blanche. Des vaisseaux sanguins entourent souvent le DRG.
3. Placez le DRG nettoyé dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un support SFM glacé.
4. Diluer le mélange de protéines gélatineuses (voir tableau des matériaux) dans du SFM glacé (1:1).
5. Plaquez le DRG ex vivo dans des plaques à 12 puits pré-enduites de 10/20 μL de mélange de protéines gélatineuses et placez-les à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 à 60 min.
6. Ajouter délicatement 1,5 à 2 mL de SFM dans le système de culture pour couvrir l’ensemble de l’explant et maintenir les explants dans des conditions de culture (37 °C et 5 % de CO2).
   note: Il s’agit d’une étape critique car le DRG n’est ancré aux plats en verre que par le mélange de protéines gélatineuses polymérisées. Le temps de polymérisation et les compétences de pipetage sont essentiels pour éviter de flotter.
7. Changez le milieu de culture du DRG toutes les 72 heures et laissez le DRG pousser aussi longtemps que nécessaire.

2. Isoler les neurones unicellulaires des DRG

1. Placez tout le DRG recueilli dans un tube stérile de 1,5 mL avec 1,2 mL de milieu F12 contenant 1,25 mg/mL de collagénase IV et incubez-le à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 45 min. Répétez cette étape pendant encore 45 min après la première incubation.
2. Traiter les explants avec 2 mL de milieu F12 contenant de la trypsine (0,025 %) pendant 30 min immédiatement après le traitement à la collagénase IV à 37 °C et 5 % de CO2.
3. Incuber avec 2 mL de milieu F12 contenant du sérum de veau fœtal (FBS ; 33 %) à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
4. Laver trois fois les explants avec 2 mL de média F12 et procéder à leur dissociation mécanique à l’aide d’une pipette en verre jusqu’à ce que le média devienne trouble.
   note: Cette procédure implique la collecte de DRG propres/parés de l’animal, comme expliqué dans la section précédente. Lors de la dissociation mécanique des explants, soyez doux et n’utilisez pas de force excessive car cela peut entraîner des déversements et une perte de matériau de travail.
5. Filtrez la culture cellulaire dissociée à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les impuretés et l’excès de tissu conjonctif. Centrifuger le lysat cellulaire filtré à (2 500 x g) pendant 2 min.
6. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de milieu neurobasal contenant un supplément pour la culture neuronale (1x), un mélange d’antibiotiques (1x), du L-glutamate (0,5 mM) et du facteur de croissance nerveuse (5 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
7. Plaquez les cellules dissociées sur des lames de couverture recouvertes de laminine (50 μg/mL ; voir le tableau des matériaux) à une densité cellulaire préférée. Déterminez la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   note: Nous avons plaqué les cellules à 25 000 cellules/lame de couverture. Cette technique permet la dissociation des neurones et des cellules gliales. La composante gliale co-cultivée avec les neurones pseudo-unipolaires joue un rôle essentiel dans la survie neuronale.