Enregistrement in vitro des oscillations thêta dans l’hippocampe de souris

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.                                                                                      

1. Préparation in vitro de l’hippocampe aigu

NOTE : L’isolement de la préparation hippocampique intacte implique trois étapes principales : (1) Préparation des solutions et de l’équipement, (2) Dissection de l’hippocampe et (3) Mise en place du système de débit de perfusion rapide nécessaire à la génération d’oscillations thêta intrinsèques. Dans ce protocole, la réalisation en temps opportun des procédures – de la dissection à l’enregistrement – est particulièrement importante car l’hippocampe isolé constitue une préparation si dense mais délicate que le maintien de la connectivité fonctionnelle de la structure in vitro nécessite un grand soin. Tout préparer à l’avance permet de s’assurer qu’un niveau de perfusion adéquat est disponible le plus tôt possible afin de minimiser les dommages cellulaires et de maintenir la fonction physiologique.

1. Solution de liquide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose (LCRa)
   1. Préparer 1X solution mère de saccharose à utiliser pour la dissection et l’incubation post-dissection. Combiner tous les composants énumérés au tableau 1, à l’exception du CaCl₂, dans 1 L d’eau désionisée et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Solution aCSF standard
   1. Préparer un LCRa standard pour la perfusion à haut débit de l’hippocampe isolé pendant les enregistrements électrophysiologiques. Pour obtenir le stock concentré (5X) aCSF, dissoudre tous les composants énumérés dans le tableau 2, à l’exception du CaCl₂, dans 2 L d’eau désionisée et conserver à 4 °C.
3. Préparer l’équipement
   1. Avant de commencer la dissection, installez la paillasse à l’aide d’un plateau en plastique rempli de glace (30 x 20 x 5 cm), de conduites de tubes reliées au carbogène et de trois boîtes de Pétri en verre (10 x 2 cm) (voir la figure 1).
   2. Ajouter 300 mL de solution de saccharose (1X stock) dans un bécher de 500 mL, le faire bouillir avec du carbogène (95 % O₂, 5 % CO₂) et ajouter Ca₂+ [1,2 mM].
   3. Transférez 60 ml de cette solution de saccharose dans une boîte de Pétri en verre et laissez-la à température ambiante. Placez le reste dans un congélateur à 4 °C pendant 10 à 15 min.
   4. Faites buliser la solution glacée de saccharose avec du carbogène tout au long de la dissection.
   5. Remplissez une deuxième boîte de Pétri (chambre froide) de solution de saccharose (4 °C) et conservez-la sur de la glace.
   6. Ajouter 30 ml de solution de saccharose glacé dans un bécher de 50 ml.

2. Dissection de l’hippocampe entier

REMARQUE : La méthode de dissection de l’hippocampe isolé est essentiellement identique à celle développée et décrite à l’origine, mais avec des détails supplémentaires et des modifications concernant le taux de perfusion et les techniques d’enregistrement.

1. Dissection cérébrale
   1. Anesthésie la souris sous une hotte à l’aide d’un petit essuie-tout imbibé de 1 mL d’isoflurane (100 %) ajouté dans la cage.
   2. Décapitez la souris anesthésiée et immergez-la rapidement dans une solution de saccharose glacée (bécher de 50 ml, ~ 5 s). Transférer sur une serviette en papier.
   3. À l’aide d’un scalpel, faites une incision cutanée médiale (caudale à rostrale) et poussez la peau sur les côtés pour exposer le crâne.
   4. Ouvrez le crâne avec de petits ciseaux et utilisez une spatule pour extraire rapidement le cerveau et le déposer dans la boîte de Pétri contenant une solution de saccharose glacée. Attendez 1 à 2 minutes pour que le cerveau refroidisse.
   5. Pendant que le cerveau se rétablit, ajoutez 2 à 3 ml de solution de saccharose dans une boîte de Pétri (dissection) recouverte de papier cristallin sur de la glace.
2. Isoler l’hippocampe
   1. Placez le cerveau sur la boîte de dissection en position verticale.
   2. Retirez le cervelet et le cortex frontal à l’aide d’une lame de rasoir. Coupez le cerveau en deux le long du plan médio-sagittal et renvoyez les deux hémisphères isolés dans la chambre de rétention. Attendez 1 à 2 minutes supplémentaires pour la récupération.
   3. Placez un seul cerveau hémiqué à la verticale sur la boîte de dissection.
   4. Faites pivoter la parabole jusqu’à ce que les structures médio-sagittales fassent face à l’observateur et que le contour encastré du complexe septal soit visible sous la forme d’une fine couche de tissu en forme de poire antérieure au thalamus.
   5. Maintenez le cerveau hémirecté stable à l’aide de la microspatule et placez la petite extrémité de la spatule recouverte de polytétrafluoroéthylène (PTFE) immédiatement derrière la zone septale (caudale à).
   6. Insérez la spatule enduite sous le septum et déplacez la pointe vers le bas jusqu’à ce que le plat de dissection soit atteint. Sectionnez les fibres qui relient la zone septale caudalement. Répétez la même opération le long du bord antérieur du septum et coupez les fibres qui se connectent à la partie frontale du cerveau.
   7. Avec la spatule tenant légèrement la partie interne du cortex juste au-dessus de l’hippocampe en position verticale, utilisez la micro-spatule pour tirer soigneusement vers le bas les noyaux thalamiques, hypothalamiques et restants du tronc cérébral. Ensuite, utilisez la spatule pour couper et retirer le tissu retiré.
   8. Retournez l’hémisphère isolé sur le côté et identifiez le contour de l’hippocampe.
   9. Insérez la spatule enduite dans le ventricule latéral sous l’extrémité rostrale de l’hippocampe dorsal.
   10. Tenez la spatule horizontalement alignée avec le plan médio-sagittal du cerveau hémiqué et faites-la glisser à travers le contour lisse des parois ventriculaires jusqu’à ce que la pointe émerge caudalement.
   11. Tenez la spatule sous l’hippocampe et appuyez légèrement sur les fibres de connexion le long de la couche intérieure où l’hippocampe se joint au cortex sus-jacent. Appliquez la micro-spatule sur le côté externe de cette couche et glissez-la contre la spatule enduite pour trancher à travers les fibres de connexion.
   12. Pour terminer l’extraction, tournez la coupelle de dissection et insérez la spatule enduite sous l’hippocampe ventral. Tenez légèrement l’intérieur du pli cortical à l’aide de la spatule et coupez les connexions entorhinales à l’aide d’un mouvement de tranchage contre la micro spatule.
       note: L’ensemble du complexe septohippocampique peut être enlevé en plaçant la spatule enduite sous l’hippocampe entier et en retirant le tissu cérébral restant en dessous.
   13. Une fois l’isolement terminé, gardez l’hippocampe posé sur la parabole et ajoutez une goutte de solution de saccharose glacée pour le garder au frais. Coupez soigneusement le cortex et les fibres restants et séparez l’hippocampe du septum en appliquant doucement une lame de rasoir à travers le fornix.
       note: Si des enregistrements par patch clamp doivent être effectués à partir de cellules pyramidales, l’hippocampe isolé peut être coupé transversalement à un angle de 45° pour exposer la couche pyramidale de Cornu Ammonis (CA)1 (préparation « coupée en angle ») sans compromettre les circuits du réseau local dans la partie restante de l’hippocampe.
   14. Transférez la préparation dans une solution de saccharose à température ambiante et laissez-la récupérer pendant 15 à 30 minutes avant de la transférer dans la chambre d’enregistrement.

3. Configurer la perfusion rapide pour l’enregistrement de l’hippocampe isolé

1. Configurer le système de perfusion par gravité pour permettre un afflux continu et rapide de LCR aXaN oxygéné à 20 à 25 mL/min.
   1. Préparez à l’avance des flacons aCSF (1X) et plongez-les dans un bain chauffant (~30 °C) au moins 15 min avant le début de l’expérience. Allumez le système de chauffage en solution en ligne (30 °C).
   2. Utilisez des barboteurs d’aquarium et des conduites de tubes reliées à un réservoir de carbogène pour oxygéner le LCRa tout au long de l’expérience, et ajoutez du CaCl₂ [2 mM] avant le début de la perfusion.
   3. Arrêtez l’écoulement d’un LCR et transférez l’hippocampe dans la chambre d’enregistrement à l’aide de l’extrémité large d’une pipette en verre. Laissez la préparation saturée de saccharose couler et se déposer au fond.
   4. Placez la préparation au centre de la chambre d’enregistrement (dans l’alignement de l’axe entrée-sortie) avec la surface lisse de CA1 et SUB sur le dessus.
   5. Stabiliser l’hippocampe avec de petits poids aux extrémités septales et temporales et relancer le flux d’un LCR.

4. Électrophysiologie dans l’hippocampe isolé

1. Enregistrement extracellulaire des oscillations thêta de l’hippocampe in vitro
   1. Pour la surveillance extracellulaire du potentiel de champ local (LFP) ou de l’activité unitaire de l’hippocampe isolé in vitro, utilisez des micropipettes en verre (1 - 3 MΩ) remplies d’aCSF. Enregistrez des signaux de potentiel de champ couplés en courant alternatif à faible bruit avec un amplificateur patch clamp de gain x1000, un filtrage passe-bande en ligne de 0,1 à 500 Hz et une fréquence d’échantillonnage de 5 à 20 kHz.
      note: Le microscope sur mesure utilisé dans ce protocole est équipé d’objectifs à faible (2,5X) et à fort grossissement (40X) pour une vue à faible grossissement de l’hippocampe, ainsi que d’une vidéomicroscopie infrarouge et d’une épifluorescence pour la reconnaissance de cellules uniques. Les composants de ce système comprennent le microscope à fluorescence vertical, des cubes de filtre à fluorescence, une caméra vidéo analogique et une carte d’acquisition d’images numérique avec logiciel d’imagerie, une chambre de perfusion personnalisée sur scène (Figure 2A, encadré i) et des micromanipulateurs de haute précision pour les enregistrements neuronaux et le placement des fibres optiques.
   2. À l’aide de la caméra montée sur le microscope et connectée à un écran d’ordinateur, vous pouvez inspecter la préparation de l’hippocampe sous un faible grossissement (2,5X) et vérifier rapidement qu’il n’y a pas de contre-dépouilles ou de dommages à la surface externe. La disposition diagonale des fibres alvéales le long de la surface lisse de CA1 doit être visible (Figure 2A, encadré ii) lorsque la lumière transmise brille à travers l’hippocampe.
   3. Utilisez l’objectif à champ large à faible grossissement pour visualiser l’hippocampe isolé et le placement des électrodes LFP dans des emplacements d’enregistrement spécifiques.
      note: La figure 2A illustre une disposition de la préparation hippocampique isolée avec plusieurs électrodes placées à différents endroits d’enregistrement.
   4. Abaissez une électrode LFP dans le bain jusqu’à ce qu’elle touche la surface (alvéus) de la zone CA1.
      note: Cela produit généralement un transitoire rapide dans l’enregistrement couplé en courant alternatif, similaire à ce qui se passe lorsque l’électrode entre en contact avec le support d’enregistrement. Un moniteur audio peut être utile pour écouter le signal du canal LFP après cette étape.
      note: Souvent, les premiers signes d’activité n’apparaissent qu’après 10 à 15 minutes, il est donc important de ne pas avancer rapidement dans la préparation. Si, après cette période, l’électrode LFP de surface ne capte toujours pas d’activité, avancez un peu plus bas dans la couche orienne et faites une pause périodique pour voir si une forme d’activité se produit à l’approche de la couche cellulaire principale. Si rien n’est détecté après 5 à 10 minutes supplémentaires, rétractez soigneusement l’électrode et placez-la ailleurs le long de la même région.
   5. Faites avancer l’électrode LFP à travers la couche pyramidale. Observez que l’activité de pointe extracellulaire augmente initialement à mesure que la décharge unitaire des neurones individuels (principalement des cellules pyramidales et inhibitrices) est détectée. Abaissez davantage l’électrode et notez que les pointes recommencent à s’estomper lorsque la pointe traverse le radiatum. Observez qu’une oscillation du réseau clairement visible dans la gamme de fréquences thêta (4 - 12 Hz) devient apparente et atteint l’amplitude maximale (~100 - 300 μV) lorsque l’emplacement d’enregistrement est abaissé à travers le radiatum.
2. Oscillations thêta dans une seule région
   1. Pour tester les propriétés spatiales des oscillations thêta spontanées à travers la région CA1, placez l’extrémité d’une électrode LFP de référence dans un site CA1 médial (situé médialement le long de l’axe septo-temporal longitudinal) et abaissez-la dans le radiatum comme décrit précédemment.
   2. Placez une deuxième électrode LFP dans un site CA1 (200 à 800 μm septal ou temporal à partir du premier LFP) et observez que les oscillations thêta CA1 peuvent se synchroniser sur des distances relativement grandes.
3. Oscillations thêta à travers les couches
   1. Pour tester les propriétés des oscillations thêta à travers les couches de l’hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site radiatum CA1. En commençant juste au-dessus de la couche orienne, abaissez une deuxième électrode dans la couche cellulaire pyramidale et à travers le radiatum. Observez une inversion progressive du signal LFP (inversion de phase relative) à travers la couche pyramidale.
      note: Pour des exemples représentatifs de ces types d’activités, voir la figure 2B. Des exemples de profils laminaires/profondeurs et d’analyse de la densité de source de courant (CSD) illustrant le site de l’inversion de phase dans l’hippocampe isolé ont déjà été publiés.

Table 1.

Tableau 2.

Figure 1 : Procédure de dissection pour la préparation isolée de l’hippocampe intact.

(a) Vue générale de la configuration de la dissection. En haut à droite : fiole de solution de saccharose glacé carbogéné (1) ; en bas à gauche : bac en plastique rempli de glace (2) contenant la coupelle de dissection recouverte de papier lentille (3) ; la chambre froide contenant une solution de saccharose (4) ; et un ensemble d’outils chirurgicaux (5). (b) Vue du cerveau de la souris avant l’hémisection sur la boîte de dissection. (c) Récupération du cerveau hémiqué dans la chambre de rétention au froid et vue zoomée (en médaillon) de l’hémisphère cérébral gauche avant d’insérer la petite extrémité de la spatule enduite sous le septum. d) Une spatule enduite placée sous l’hippocampe isolé, le long de la région CA1/SUB, avec le tissu cérébral restant, est retirée par le dessous.

Figure 2 : Configuration de l’installation pour l’enregistrement in vitro des oscillations thêta à partir de la préparation de l’hippocampe intact dans la chambre d’enregistrement immergée.

(a) L’hippocampe isolé est représenté avec une disposition des régions de l’hippocampe et de multiples électrodes placées dans quatre sites d’enregistrement différents répartis septo-temporelement (indiqués par des astérisques blancs). Dans la vue de la plate-forme de la chambre d’enregistrement illustrée ci-dessus (encadré i), l’entrée et la sortie de l’écoulement à perfusion rapide sont indiquées par des chiffres (1, 2). Dans l’image agrandie de l’hippocampe ci-dessous (encadré ii), une seule électrode est placée dans le CA1 médiéto-temporal, et les fibres de l’alvéus sont facilement visibles, en diagonale vers le subiculum. S : septal, T : temporal, f/fx : fimbria-fornix. (b) Représentation schématique de l’organisation des couches CA1 avec des traces LFP représentatives enregistrées simultanément à partir de la stratum oriens (gris) et du stratum radiatum (noir). Notez la phase inversée des signaux entre les deux couches. Alv : stratum alveus, PR : stratum pyramidale, SR : stratum radiatum. SLM : Stratum lacunosum moleculare. c) Exemple de trace LFP montrant une oscillation thêta spontanée enregistrée à partir de la zone CA1/SUB (segment de 20 secondes) et des segments élargis de 2 secondes (ci-dessous) à partir du signal non filtré ; filtré passe-bande pour les fréquences thêta (0,5 - 12 Hz) ; gamma lent (25 - 55 Hz) ; et gamma rapide (125 - 250 Hz).