Induire une lésion cérébrale traumatique pénétrante chez les mouches drosophiles adultes

1. Traumatisme cérébral pénétrant (PTBI ; Graphique 1)

1. Triez les mouches F1 nouvellement fermées. Sélectionner les jeunes mâles dans les 6 heures suivant l’éclosion. Placez ces mâles dans des flacons propres contenant de la nourriture, avec 40 mouches ou moins par flacon.
   REMARQUE : Ceci est plus facile à accomplir en milieu de matinée en anesthésiant les mouches sur le tampon CO₂ et en identifiant les mâles adultes qui ont encore du méconium (visible sous la forme d’une tache verdâtre foncée à travers la paroi abdominale) dans leurs intestins.
2. Désinfectez les broches Minutien (voir le tableau des matériaux) pendant au moins 5 minutes en plaçant ~100 broches dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli d’éthanol à 70 %.
3. Désinfectez le tampon de CO₂ et un pinceau en vaporisant de l’éthanol à 70 % et essuyez-les avec un mouchoir propre et non pelucheux. Une fois que les outils sont propres et secs, transférez 40 mâles F1 triés ou moins sur le tampon propre.
4. Séparez les mâles F1 en 2 groupes sur le coussin de mouche. Un groupe servira de témoin, les mouches non blessées. Le deuxième groupe expérimental sera soumis à l’ITPT.
5. À l’aide d’une pince, retirez 4 à 5 nouvelles broches Minutien du tube de microcentrifugation et placez-les près du bord du tampon de CO₂. Sous la lunette de dissection, choisissez une goupille Minutien droite avec une pointe acérée.
   REMARQUE : L’utilisation d’une seule broche Minutien pour une expérience réduira la variabilité. Réutilisez les goupilles pointues. Placez les broches endommagées ou émoussées dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 ml contenant 70 % d’éthanol pour une élimination en toute sécurité.
6. Si vous travaillez avec des mouches à partir de la croix standard, allumez la lampe à diode électroluminescente (LED) du stéréomicroscope équipée des filtres d’excitation et d’émission appropriés pour la protéine de fluorescence verte (GFP). Cela permet une excitation à 440-460 nM et permet la visualisation de 500-560 nM.
   REMARQUE : Avec cet ensemble de lampe et de filtre, les corps cellulaires du corps du champignon deviendront fluorescents en vert à travers la cuticule de la tête (Figure 1C). Pour les mouches perma-jumelles ou les mouches d’autres génotypes, un illuminateur de lumière blanche standard pour le stéréomicroscope peut être utilisé pour visualiser les points de repère sur la cuticule de la tête afin de cibler la blessure au corps du champignon (Figure 1C).
7. À l’aide de la pince, vous pouvez saisir et tenir l’épingle Minutien sélectionnée dans une main (pour les droitiers, il s’agit généralement de la main droite) et le pinceau dans l’autre main (généralement gauche). Choisissez une mouche dans le groupe expérimental et positionnez-la de manière à avoir une vue dorsale de la capsule céphalique avec la tête de la mouche vers la droite. Placez la brosse sur la partie antérieure du thorax dorsal et appuyez doucement vers le bas pour stabiliser la mouche
.
8. Dirigez l'extrémité de la broche Minutien vers les corps cellulaires du corps du champignon sur le côté droit de la tête et pénétrez la capsule céphalique. Si vous utilisez des points de repère, ciblez la cuticule de la tête dorsale entre les ocelles et le bord dorsal de l’œil (figure 1).
9. Une fois la blessure terminée, utilisez le pinceau pour pousser doucement la tête de la goupille Minutien.
10. Si vous utilisez le cerveau pour le RNA-Seq ou le qRT-PCR, faites une deuxième blessure sur le côté gauche de la tête.
11. Répétez les étapes 2.8-2.10 pour blesser toutes les mouches du groupe expérimental.
12. Une fois que toutes les mouches ont été blessées, placez le témoin et les mouches blessées dans des flacons étiquetés et séparés contenant de la nourriture. Posez les flacons horizontalement (c’est-à-dire sur les côtés) pendant que les mouches se remettent de l’anesthésie et pendant le vieillissement ultérieur pour éviter que les mouches ne se coincent dans la nourriture.
13. Placez les mouches croisées standard à 25 °C et les mouches perma-twin à 30 °C pour vieillir.
14. Pour les mouches âgées de plus de 24 h, placez-les sur des aliments propres tous les 1 à 2 jours.

Figure 1 : Lésion cérébrale traumatique pénétrante (TCPT) au cerveau central de la drosophile adulte. (A) Schéma de l’extérieur d’une tête de mouche adulte. Il s’agit d’une vue frontale. Ainsi, le côté droit de l'animal est à la gauche du spectateur. (B) Schéma de l’intérieur d’une tête de drosophile adulte avec la trajectoire de la blessure indiquée en gris. Il s’agit d’une vue postérieure. Ainsi, dans cette image et les figures suivantes, le côté droit du cerveau est à droite. Le PTBI du cerveau central affecte plusieurs structures cérébrales, y compris le corps du champignon (vert) et les tissus à l’extérieur du cerveau, y compris le corps adipeux (bleu) et les hémocytes (rouge). CB = région centrale du cerveau. OL = région du lobe optique. (C) Vue dorsale d’une tête adulte vivante dans laquelle les corps de champignons (pointes de flèches) sont marqués avec une protéine fluorescente verte (GFP). Il s'agit du « génotype standard » (voir le texte pour plus de détails). Le protocole PTBI entraîne de manière reproductible des lésions aux corps des champignons.