Imagerie de motoneurones marqués par fluorescence dans une jambe de drosophile adulte

TOUTES les procédures se trouvent pour le tejlat elk

1. Dissection et fixation des jambes

1. Prenez une plaque multi-puits en verre et remplissez le nombre approprié de puits avec 70 % d’éthanol. Ajoutez 15 à 20 mouches anesthésiées au dioxyde de carbone (des deux sexes et de n’importe quel âge) dans chaque puits et, à l’aide d’un pinceau, tamponnez doucement les mouches dans la solution d’éthanol jusqu’à ce qu’elles soient complètement immergées.
   REMARQUE : Cette étape supprime l’hydrophobicité de la cuticule. Ne pas laver plus d'1 minute, car cela augmente l’auto-fluorescence de la cuticule.
2. Rincez les mouches trois fois avec une solution détergente tensioactive non ionique à 0,3 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez les mouches dans cette solution pendant au moins 10 minutes.
   REMARQUE : Les pieds sont mieux fixés lorsque le détergent est inclus, car cela risque d’augmenter la pénétration du fixateur à l’intérieur de la jambe.
3. Place une plaque multi-puits sur la glace avec un tube de 4 % de paraformaldéhyde (PFA).
   REMARQUE : Il est essentiel de préparer une solution mère fraîche à 4 % de PFA à partir d’une solution mère sans éthanol à 16 % de PFA.
4. Utilisez une pince pour enlever la tête et l’abdomen des mouches sans endommager le segment thoracique ou les pattes.
   REMARQUE : L’ablation de l’abdomen facilite la tenue de la braguette et la dissection des pattes.
5. Disséquez les pattes du segment thoracique à l’aide d’une pince et placez-les dans les puits contenant 4 % de PFA. À l’aide de la pointe d’une pince fine, poussez doucement mais fermement à la jonction coxa-thorax jusqu’à ce que la jambe se détache.
6. Fixez les pattes avec 4 % de PFA pendant la nuit à 4 °C (environ 20 h au total).
7. Lavez les jambes avec une solution détergente tensioactive non ionique à 0,3 % dans 1x PBS, 5x pendant 20 min chacune.
8. Remplacez le tampon de lavage par un support de montage. Gardez la jambe dans le milieu pendant au moins une journée avant de monter pour permettre sa pénétration complète dans la jambe.
   REMARQUE : Si le support de montage est très visqueux, diluez-le à 80 % avec 1x PBS car un changement soudain de viscosité peut provoquer l’affaissement de la cuticule et endommager la structure globale de la jambe. Selon le pilote Gal4, les mouches peuvent être conservées pendant 1 à 3 semaines à 4 °C dans le support de montage jusqu’au montage.

2. Leg Mounting

1. Placez environ 20 μL de glycérol à 70 % sur le côté gauche d’une lame de microscope et recouvrez d’une lamelle carrée de 22 x 22 mm² (Figure 1A, B). Pipeter environ 10 μL de milieu de montage le long d’une ligne parallèle et à une petite distance du bord droit de cette lamelle. Ajoutez 30 μL supplémentaires de support de montage sur le côté droit de la glissière (Figure 1C).
   REMARQUE : Lors de l’application d’une lamelle sur les jambes (voir ci-dessous), le support de montage s’étendra doucement sous la lamelle et autour des jambes sans les déplacer.
2. À l’aide d’une pince fine, soulevez la jambe de la solution et posez-la doucement sur le support de montage près de la lamelle gauche. Faites de même pour chaque jambe et alignez-les de haut en bas (Figure 1D).
   1. Soulevez et transférez les jambes en une goutte de médium maintenue entre les deux pointes de la pince. Orientez les jambes de deux façons : côté externe vers le haut ou vers le bas.
3. Une fois que toutes les pattes (jusqu’à 6 à 8 pattes peuvent être montées) sont correctement alignées, placez une deuxième lamelle sur les pattes de sorte que cette lamelle repose légèrement sur la lamelle précédemment placée (Figure 1E) pour laisser de l’espace entre la lamelle et le tissu et pour éviter que les pattes ne soient endommagées (Figure 1G).
   REMARQUE : Vous pouvez également utiliser des puits d’autocollants ou de la cire orthodontique pour créer un espace entre la lamelle et la diapositive.
4. Utilisez un vernis à ongles pour fixer la position des lamelles à chaque coin (Figure 1F).
   REMARQUE : Le tissu est maintenant prêt à être photographié.

3. imaging

1. Configurez une seule piste à l’aide du laser 488 nm et de deux détecteurs simultanément pour obtenir la fluorescence GFP et l’auto-fluorescence de la cuticule. À l’aide de la commande de portée ou de l’affichage du curseur dans la fenêtre spectrale de la fenêtre du trajet lumineux du logiciel, réglez la portée de détection d’un détecteur (détecteur 1) entre 498 et 535 nm et celle de l’autre (détecteur 2) entre 566 et 652 nm.
   REMARQUE : Typiquement, le détecteur un doit être un détecteur GaAsP, et le détecteur deux doit être un tube photomultiplicateur. Le canal 498-535 détecte de manière optimale le signal GFP, mais détecte également l’autofluorescence de la cuticule. Cependant, le canal 566-652 ne détecte que l’autofluorescence de la cuticule (Figure 2A).
2. Utilisez un objectif à immersion à l’huile 20X ou 25X, une résolution de 1024 x 1024 pixels, une profondeur de 12 bits, et définissez l’espacement Z sur 1 μm. Définissez le temps de séjour des pixels sur environ 1,58 μs, et faites la moyenne de deux images/image. Utilisez des objectifs à grande ouverture numérique.
3. Règle tous les autres paramètres, en fonction du microscope confocal et du logiciel d’imagerie utilisés.
   1. Assurez-vous d’obtenir un signal de cuticule plus clair avec le détecteur 566–652 plutôt qu’avec le détecteur 498–535. Pour ce faire, utilisez la même puissance laser que le laser 488 pour les deux détecteurs. À l’aide des marqueurs de saturation, ajustez d’abord le gain du détecteur 1 pour obtenir un signal GFP suffisamment lumineux (Figure 2B, D). Ensuite, ajustez le gain du détecteur 2 pour vous assurer que certaines zones avec un signal de cuticule élevé (bords des pattes, articulations) produisent un signal saturé dans ce détecteur (Figure 2C, E).
   2. Si la jambe est allongée et trop grande pour être imagée dans une seule image, utilisez l’option Tuile ou Position du logiciel d’imagerie microscope.
4. Reconstruisez les images finales soit à l’aide du logiciel d’imagerie microscopique propriétaire, soit à l’aide du logiciel gratuit ImageJ/FIJI (voir ci-dessous).

4. Post Imaging Processing

1. Ouvre la pile confocale dans ImageJ/FIJI.
   1. Utiliser le plugin Bioformats (Plugins| Bio-Formats| Bio-formats Importer) en FIDJI pour ouvrir les images qui ne sont pas en . TIF à partir de progiciels d’imagerie propriétaires.
2. Divise les canaux en sélectionnant Image| Couleur| Diviser les chaînes.
   >REMARQUE : Si des images de plusieurs positions ont été créées et doivent être recombinées, utilisez le plugin d’assemblage par paires dans FIJI à partir de (Plugins > Assemblage > Assemblage par paires).
3. Pour soustraire le signal cuticulaire du signal GFP, ouvrez le calculateur d’images (Process| Calculatrice d’image) : sélectionnez la pile du détecteur un en tant qu’Image 1 (GFP + cuticule) (Figure 3A), dans la fenêtre de fonctionnement, sélectionnez soustraire et sélectionnez la pile du détecteur deux en tant qu’Image 2 (cuticule) (Figure 3B). Par conséquent, seul le signal GFP endogène (GFP) est obtenu (Figure 3C).
   1. Fusionne cette pile (GFP) avec la pile 'cuticule uniquement' obtenue du détecteur 2 (Figure 3B Image| Couleur| Fusionner les canaux) pour obtenir une image RVB comprenant le signal GFP spécifique au tissu ainsi que le signal de la cuticule, ce qui permet d’identifier les arborescences axonales dans les segments de jambe (Figure 3D).
   2. Ajustez le contraste et la luminosité de chaque image (Image| Ajuster| Luminosité/Contraste), puis générer une seule image RVB (Image| Type| Couleur RVB).
      REMARQUE : Pour générer une projection maximale de la Z-stack (Image| Piles| Z Project...), utilisez la projection d’intensité maximale pour le signal GFP et l’intensité moyenne pour la cuticule, qui peut ensuite être ajustée en termes de luminosité avant de fusionner les deux canaux.
4. Sinon, utilisez une macro pour la soustraction et le traitement automatiques des images dans ImageJ/FIJI. Copiez le texte dans le fichier supplémentaire 1 dans l’éditeur de macros (Plugins| Nouveau| Macro), enregistrez la macro dans le dossier Plugins, et redémarrez ImageJ/FIJI une fois pour pouvoir utiliser la macro.
   1. Pour utiliser la macro, ouvrez la pile confocale et ouvrez la fenêtre Luminosité/Contraste (Image| Ajuster| luminosité/contraste). Ensuite, exécutez la macro (Plugin| Macro| Exécuter) et suivez les instructions.
   2. Lorsqu’on vous demande de spécifier l’opération (fenêtre de la calculatrice d’images), choisissez Image 1 comme pile 1 (GFP), Image 2 comme pile 2 (cuticule) et Soustray.
      REMARQUE : La macro génère une image de projection maximale du signal GFP traité (MAX_Result de stack1), une projection moyenne de la cuticule (AVG_stack2), le résultat de la soustraction de la pile de cuticules de la pile GFP (Résultat de stack1) et de la pile de cuticules non traitée (stack2).
   3. Lorsqu’on vous demande d’ajuster le contraste, utilisez les commandes de la fenêtre de luminosité/contrôle pour ajuster la luminosité/contraste de l’image de projection maximale de la GFP et de la projection moyenne de la cuticule pour générer une image fusionnée RVB des deux signaux montrant la GFP en vert et la cuticule en gris. Fusionnez les résultats de stack1 et stack2 pour générer de la même manière une GFP et une pile de cuticules combinées qui peuvent être utilisées à l’étape suivante.
5. Pour visualiser les pieds en trois dimensions, utilisez un logiciel 3D spécialisé avec les piles nouvellement générées (Figure 3E).
   1. Ouvre la pile RVB avec un logiciel 3D (voir Table des matériaux). Dans la fenêtre contextuelle de la boîte de dialogue, sélectionnez tous les canaux dans la section de conversion de mode et entrez la taille d’un voxel (volume d’un pixel).
      REMARQUE : Toutes les informations nécessaires sont contenues dans les fichiers d’image du logiciel de microscope propriétaire utilisé.
   2. Sur le module du canal 2 (signal GFP), faites un clic droit et sélectionnez Affichage | volren. Ensuite, faites un clic gauche sur le module volren. Dans la section des propriétés (en bas à gauche de l’écran), cliquez à gauche sur Modifier et sélectionnez volrengreen.col. Sur le module du canal 1 (signal de cuticule), cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Affichage | Volren. Ensuite, faites un clic gauche sur le module volren. Dans la section Propriétés, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur avancé et sélectionnez DDR (un affichage transparent semblable à une radiographie), puis ajustez la valeur gamma pour voir l’arrière-plan de la cuticule (Figure 3E).
   3. Pour générer une rotation 3D, faites un clic droit sur le module de pile du projet. Sélectionnez ensuite animer| tourner. Faites un clic gauche sur le module de rotation.
   4. Dans la section des propriétés, cliquez sur utiliser bbox center. Sur le module de rotation, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez calcul| cinéaste. Dans le module Movie Maker, cliquez sur le bouton gauche de la souris. Dans la section des propriétés, cliquez à gauche sur Avancé (en haut à droite de la section des propriétés).
   5. Dans le champ du nom de fichier, remplissez le nom de la rotation du film. Dans le champ qualité, écrivez 1 (qualité max). Laissez le cadre à 200 si une rotation de 8,3 s est souhaitée (ce nombre peut être diminué ou augmenté pour modifier la vitesse de rotation). Appuyez ensuite sur appliquer (bouton vert, en bas à gauche de la section des propriétés

Figure 1 : Procédure de montage des pieds sur les lames de microscope.

Figure 2 : Procédure d’imagerie. (A) Les spectres d’émission de GFP et de cuticule de jambe à l’aide de l’excitation laser Argon de 488 nm ont été obtenus à l’aide de l’imagerie spectrale de sections de jambes exprimant la GFP et de jambes de Drosophila qui n’expriment pas GFP, respectivement. Notez que les intensités de fluorescence n’ont pas été normalisées, par exemple, qu’elles proviennent de données brutes utilisant les mêmes paramètres (objectif, support de montage, puissance laser, ouverture confocale, gain, décalage) que pour la procédure d’imagerie de la jambe. Les fenêtres du détecteur utilisées pour l’imagerie de la GFP + fluorescence de la cuticule (détecteur 1 : vert) et de la cuticule (détecteur 2 : rose) sur la base des spectres de fond GFP vs cuticule sont également illustrées. (B, C) La section confocale des jambes a été marquée avec mCD8 ::GFP sous le contrôle de DVGlut-Gal4 et obtenue à partir du détecteur 1 (B) et du détecteur 2 (C). (D, E) Les paramètres de marqueur de saturation sont utilisés pour les images (B et C) respectivement (voir le texte pour l’explication) : bleu sans signal, saturation rouge. Notez que sur le détecteur 1, les principales voies nerveuses sont saturées, tandis que sur le détecteur 2, certaines régions de la cuticule sont saturées (voir flèches). Barre d’échelle = 100 μm.

Figure 3 : Traitement des images à l’aide d’ImageJ/FIJI. (A) Projection maximale des piles confocales obtenue à partir d’un détecteur de 498-535 nm. (B) Projection maximale de l’empilement confocal obtenue à partir d’un détecteur de 566-652 nm. (C) Une image avec seulement un signal GFP a été obtenue en soustrayant (A) de (B). (D) Images fusionnées de (B) et (C). (E) Reconstruction 3D de (C). Barre d’échelle = 100 μm.